Summary
Denne protokol præsenterer en ny kirurgisk teknik til musenyretransplantation med fokus på en modificeret arteriel anastomosestrategi. En vaskulær suturteknik, herunder en enkel og sikrere ureter-blære anastomose metode er også præsenteret. Disse ændringer forkorter operationstiden og forbedrer succesraten for musens nyretransplantationsprocedure.
Abstract
Nyretransplantation hos mus er en kompliceret og udfordrende operationsprocedure. Der er meget få publikationer, der viser de vigtigste trin i denne operation. Derfor introducerer denne artikel teknikken og påpeger de kirurgiske forbehold, der er forbundet med denne operation. Derudover demonstreres vigtige ændringer i forhold til den konventionelle procedure. For det første skæres og forberedes en plet af abdominal aorta således, at de proksimale bifurkationer af nyrearterien, herunder urinlederarterien, transekteres sammen med donornyreen en blok. Dette reducerer risikoen for en urinledernekrose og undgår udviklingen af en urinvejsokklusion. For det andet demonstreres en ny metode til vaskulær anastomose, der gør det muligt for operatøren fleksibelt at øge eller mindske størrelsen af anastomosen, efter at nyretransplantationsreperfusion allerede er påbegyndt. Dette undgår udviklingen af karstrikturer og intraabdominal blødning. For det tredje vises en teknik, der muliggør anastomose af den sarte donorurerør og modtagerblæren, der ikke forårsager et traume. Vedtagelse af denne protokol kan forkorte driftstiden og reducere skaden på modtagerens blære og derved øge operationens succesrate for modtagermusene betydeligt.
Introduction
Siden Sakowitz et al. udviklede musemodeller for nyretransplantation i 1973 for første gang1, har det vist sig at være et vigtigt eksperimentelt redskab til at studere mekanismerne for transplantation iskæmisk skade og alloimmun afvisning samt til at udvikle nye behandlinger med det formål at forlænge allograftoverlevelsen og muligvis opnå immunologisk tolerance. Den kirurgiske teknik har imidlertid vist sig at være kompleks og meget krævende, undertiden med komplikationer såsom vaskulære anastomotiske strikturer, der fører til præerenal ikke-immunologisknyretransplantationssvigt 2, postrenal svigt forårsaget af iskæmi og efterfølgende nekrose af den transplanterede urinleder, strikturer af anastomosen i den transplanterede urinleder og / eller modtagerens urinblære, der fører til en forstyrrelse af urinudstrømningen. Alt dette er grunden til, at nyretransplantation i mus ikke er blevet videreudviklet og derfor ikke er meget udbredt. Etablering af en effektiv og langsigtet stabil musenyretransplantationsmodel uden vaskulære og urinvejskomplikationer har stadig uerstattelig betydning for mange undersøgelser på transplantationsområdet med fokus på de nyreimmunmedierede, men også infektionssygdomme3. Sammenlignet med andre organtransplantationer i murinmodeller som lunge-, hjerte- og tarmtransplantation 4,5 giver musenyretransplantationsmodellen desuden en chance for at studere langsigtet overlevelse, selv i indstillingen af større histokompatibilitetsantigenforskel 3,6. Det har også vist sig, at i samme indstilling af donor-modtager-stammekombinationer er forskellige organtransplantationer såsom hjerte eller nyre karakteriseret ved forskellige dynamikker og udbrud af allograftafstødning3. Desuden er det fra nefrologisk synspunkt en mere egnet model til at studere parenkymmedierede immunreguleringsmekanismer i forbindelse med akutte og kroniske afstødningshændelser end enkle hudtransplantationsforsøg.
På baggrund af tidligere rapporter om den kirurgiske teknik til nyretransplantation hos mus 3,7,8,9 demonstrerer vi her følgende pålidelige forbedringer, der med succes er blevet anvendt i løbet af de sidste 10 år inden for vores gruppe10,11,12: For det første bevares urinpulsåren sikkert, da nyrearterien resekteres en bloc sammen med den respektive del af abdominal aorta. For det andet en ny, enkel og hurtig teknik til en knudeløs vaskulær anastomose, hvor den endelige søm af anastomose ikke er bundet med enden af det øvre slips som den traditionelle tilgang, men forbliver fri. Denne teknik gør det muligt at øge eller formindske størrelsen af anastomosen efter nyrereperfusion for at undgå karstriktur og intraabdominal blødning. For det tredje blev 21 G og 30 G sprøjtenåle anvendt som et hjælpeværktøj til punktering for at implantere donoruretanden i modtagerens blærevæg, hvilket reducerede skaden på modtagerens blære og lettede dannelsen af strikturfri anastomose.
I denne rapport sammenlignede vi også den traditionelle, udbredte teknik med den modificerede, der er etableret i vores laboratorium og fandt ingen signifikant forskel i graden af nyretubulær atrofi og nyretransplantation interstitiel vævsfibrose. I tidligere undersøgelser sammenlignede vi desuden resultaterne af denne nye teknik med den konventionelle metode med hensyn til lokal blødning, trombose, tid til at udføre karanastomose og overlevelsesrate. Vi fandt forbedringer såsom signifikante reduktioner af lokale trombosehændelser (1,1% versus 6,6%), en reduceret tid for anastomoseproceduren og en meget reproducerbar nyre syngeneisk transplantat langsigtet overlevelse (95% versus 84% med den klassiske tilgang)10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Europa-Parlamentets direktiv 2010/63/EU om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål (Dyreetikkort: Niedersachsens ministerium for fødevaresikkerhed, #33.9-42502-04-11/0492). Udfør procedurer ved hjælp af sterile kirurgiske instrumenter og forbrugsstoffer (autoklaveret) og prøv at holde operationsområdet så sterilt som muligt.
BEMÆRK: C57BL/6J hanmus fungerede som donorer og modtagere (syngeneisk transplantationsmodel), mens Balb/c-mus fungerede som nyreallograftmodtagere (model til undersøgelse af akut allograftafstødningsmodel9). Mus var i alderen mellem 8-12 uger, vejede ~ 25-30 g ved transplantation og blev anbragt under standardbetingelser. Data rapporteret i dette manuskript blev genereret af fire kirurger med erfaring i musekirurgi.
1. Forberedende trin
- Til kirurgi skal du bruge et sæt mikroskopiske instrumenter, herunder en mikrosaks, mikrotang, en nåleholder, mikro hæmostatiske klemmer og en elektrokirurgisk pen. Udfør suturer ved hjælp af 7/0er, 10/0er eller 4/0er nylonmonofilament.
- Til anæstesi skal musen placeres i kassen til indånding af isofluran (2%) i ca. 40-60 s for at fremkalde bevidstløshed.
- Når musen er anæstesi, skal musen vejes.
- I henhold til musens vægt skal du anvende en intraperitoneal injektion af ketamin (100 mg / kg) + xylazin (10 mg / kg) + acepromazin (2 mg / kg) for at anæstesiere musen13. Bekræft, at musen er anæstesi ved at observere manglende reaktion på en tåklemme.
- Når anæstesi er trådte i kraft, klip mavepelsen. Fastgør derefter musen på operationsbordet ved løst at immobilisere lemmerne med et sterilt maskeringstape.
- Desinficere musens underliv efter at have placeret musen på operationsbordet. Udfør desinfektion ved hjælp af skiftevis skrubbe af povidoniodid (iodphor) og alkohol tre gange (brug koncentrisk mønster, start skrubbe midt i maven og bevæg dig udad), og draper musen derefter korrekt ved hjælp af et fenestrated kirurgisk håndklæde.
- Påfør øjensalve og oprethold sterilitet under hele proceduren.
BEMÆRK: Antibiotika anbefales ikke under hele proceduren, da disse stoffer kan påvirke immunologiske reaktioner.
2. Procedure for donoroperation
- Brug en saks til at skære huden og udføre et tværsnit på tværs af maven på ca. 3-4 cm. Skær musklerne i abdominalvæggen. Dæk og flyt forsigtigt væk indvoldene med en saltvand imbibed gasbind.
- Brug en vatpind til forsigtigt at fjerne tarmene, maven og milten mod højre side (fra musens synspunkt), dække og forsigtigt flytte indvoldene væk med en saltvand imbibed gasbind.
- Brug mikro tang til at udsætte venstre nyre, aorta og ringere vena cava (IVC).
- Brug en elektrokirurgisk blyant til at cauterize venstre lændehvirvelvener, herunder deres underliggende grene og andre små kar sammen med venstre binyrekar, omhyggeligt.
- Brug mikrosaks og tang til at dissekere venstre urinleder og forsigtigt mobilisere den fra det omgivende væv. Ren skære det tæt på urinblæren. Mobiliser aortaområdet mellem venstre og højre nyrearterier ca. 2 mm i længden.
- Brug mikro tang til at adskille den infrarøde ringere vena cava (IVC) og aorta, og brug derefter buede tang til at passere under aorta for at placere et løst slips på 7-0 silkesutur omkring dette kar.
- Krydsklemme området af aorta under højre nyrearterie og den ringere vena cava (IVC) ved hjælp af to 5 mm mikrovaskulære klemmer.
- Transekter den venstre nyrevene fra vena cava.
- Brug en sprøjte til at skylle aorta med 1 ml heparin saltopløsning (60 U / ml).
- Brug mikro tang til at stramme ligaturen, der påføres i trin 2.5. Skær derefter aorta under ligaturen såvel som under den proksimale klemme. Med dette er de proksimale bifurkationer af nyrearterien (bemærk venligst, at arteriel åbning skal skæres pænt, ellers vil det påvirke anastomosen) og urinlederarterien inkluderet og transekteret en bloc. Forbered dig omhyggeligt, så den sarte ureterale arterie er fuldstændig bevaret.
- Brug den elektrokirurgiske blyant og tang til at frigøre venstre nyre og tilhørende kar fuldstændigt ved forsigtigt at cauterisere alt kar, der omgiver væv. Fjern nyren og opbevar den i saltopløsning ved 4 °C.
- Afliv den abesatte donormus ved halshugning.
3. Proceduren for modtageroperation
- Udfør de indledende kirurgiske trin (herunder anæstesi og sterilisering, se trin 1.1 til 1.7) som beskrevet for donormusen.
- Brug en saks til at åbne maven via et median snit (ca. 2,5 cm i længden), og dæk derefter abdominale organer med en våd gasbind ved hjælp af saltopløsning.
- Bevar omhyggeligt den infrarøde aorta og ringere vena cava (IVC), og sørg for, at hver stor kargren er cauterized. Brug også den elektriske cautery til at dissekere venstre urinleder forsigtigt i en position, der er tæt på nyrebækkenet. Fjern derefter den venstre nyre.
- Brug mikropincet og vatpinde til at udsætte abdominal aorta og ringere vena cava og løsne dem fra det omgivende fedtvæv (ca. 4 mm i længden).
- Brug to mikrovaskulære klemmer og placer dem i nærheden og distalt på både den ringere vena cava og abdominal aorta samtidigt.
- Brug en mikronåleholder til at styre en 10/0 monofilament (lavet af syntetisk fiber med en glat overflade) suturnål, som placeres gennem aortavæggen på en proksimal til distal måde.
- Opnå en elliptisk arteriotomi på ca. 1 mm med en blid opadgående trækkraft i suturen, mens du skærer direkte under nålens underside med en fin, buet saks.
- Brug mikrosaks til at skære den ringere vena cava (IVC) i længderetningen med tilstrækkelig længde på ca. 1,5 mm. Placer dette snit lidt under dets aorta-modstykke.
- Udfør donor og modtager aorta anastomose på en ende-til-side måde. Placer donornyren på højre side af modtagerens ringere vena cava, der justerer manchetten på donorens abdominale aorta med anastomosen af modtagerens abdominale aorta.
- Brug en mikronåleholder og to separate 10-0 suturer til at sy de proksimale og distale ender af anastomosen.
- Efter binding skal du lade de to lange suturer, inklusive nålen, være på plads. Sy venstre side af anastomosens aortalvæg kontinuerligt med to jævnt fordelte sting i en distal-proksimal retning.
- Efter den sidste søm skal suturen ledes gennem en delvis tykkelse af karvæggen over det øvre suturbind.
- Brug mikro tang til samtidig at udøve blid trækkraft til den korte ende af det nederste suturbånd.
BEMÆRK: I denne nye knudeløse teknik er den sidste søm ikke bundet til den korte ende af det øverste slips. - Brug mikro tang til at vende den transplanterede nyre til sin normale position. Sy nu kontinuerligt den højre væg af aortal anastomose ved hjælp af tre sting på en proksimal til distal måde.
BEMÆRK: Sammenlignet med den konventionelle kirurgiske teknik 7,8 er den sidste sutur fusioneret med det distale slips i nærheden. Bind det ikke til enden af den nederste sutur, skær den for at efterlade en fri længde på 2-3 mm i stedet. - Udfør den venøse anastomose ved hjælp af den samme sutureringsprocedure som tidligere beskrevet med den forskel, at der er behov for fire til fem sting for hver side af anastomosen. Den endelige søm efterlades som en fri ende af samme længde svarende til den ovenfor beskrevne aortale anastomose.
- Når du har afsluttet begge anastomoser, skal du bruge en tør vatpind til at udøve et blidt tryk mod det suturerede område i ca. 10-20 s.
- Brug en clipsapplikator tang til at fjerne begge klemmer, først den nederste og derefter den øverste. Skyl bughulen med 0,9% natriumchlorid ved en temperatur på 38,0 °C.
- Overhold reperfusionen af den transplanterede nyre.
4. Ureteral implantation
- Brug en mikronåleholder til at trænge igennem modtagerens urinblære med en 10/0 sutur (lige nål) og indsæt den i en 21 G nålelumen for vejledning (se supplerende figur 1a).
- Før nu 21 G-nålen til at sy et hul på stedet for den forrige nålepåføring (supplerende figur 1b).
- Træk 21 G-nålen ud (supplerende figur 1c).
- Brug en mikronåleholder og 10/0 sutur til at sy (ingen slips) den trimmede ureterende og perforere blæren med denne 10/0 sutur igen på indgangsstedet (supplerende figur 1d).
- Brug en mikronåleholder til at trække 10/0 filamentet og urinlederen ind i urinblæren gennem det konstruerede hul (supplerende figur 1e).
- Brug en mikronåleholder og en anden 10/0 sutur til at anastomose donorens urinleder til modtagerens urinblære. Her skal du forbinde urinlederens ydre membran til blærevæggens ydre membran og udføre intermitterende suturer med 3 til 4 sting. Til sidst trækkes trækkraftsuturen ud (supplerende figur 1f).
- Brug tang til at placere tarmene tilbage i bughulen. Udfør to-lags suturer (først mavemusklerne efterfulgt af huden) for at lukke mavesåret ved hjælp af en 4/0 filament.
- Placer de transplanterede mus i et ilt- og temperaturkontrolleret kammer til genopretning efter operationen.
- Ved postoperativ analgesi skal Metamizol gives 200 mg/kg pr. os efter operationen.
Fire og 16 timer efter operationen giver Metamizol 200 mg/kg pr. os plus Carprofen (5 mg/kg) s.c. I den videre opfølgning påføres Carprofen (5 mg/kg) s.c. på de transplanterede mus hver 24. time i tre på hinanden følgende dage efter operation13. Hvis der er tegn på utilstrækkelig analgesi, gives buprenorphin 0,05 mg/kg desuden hver 8. time s.c.
5. Kontralateral nefrektomi og ofring af modtagermusen
BEMÆRK: Udfør kontralateral nefrektomi af modtagermusen 5 dage efter transplantationen.
- Udfør den kontralaterale nefrektomi af den transplanterede mus 5 dage efter transplantation under anæstesi. Ligate og skære modtagerens autologe højre nyrearterier og vener, fjern højre nyre og luk bughulen. Den postoperative pleje og analgesi er den samme som beskrevet før (se trin 4.7).
- Hæv og optag musens tilstand. Giv den transplanterede mus postoperativ analgesi, mad og vandforsyning.
- Fire uger efter transplantationen ofres halvdelen af de transplanterede mus og udfører H&E-farvning til deres nyretransplantationer.
- 12 uger efter transplantationen skal du ofre de resterende mus og udføre Masson Gold-farvning af disse nyretransplantationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fire uger efter transplantationen viste både den modificerede teknik såvel som den konventionelle teknik moderate tegn på nyretubulær atrofi14,15 sammenlignet med de indfødte modtagerkontolatrale nyrer (figur 1). Graden af nyretubuli atrofi viste ingen signifikant forskel mellem de to forskellige teknikker. Masson Goldners trikromfarvning14,15 af nyrerne 12 uger efter transplantationen viste ensartet tydelige tegn på interstitiel vævsfibrose sammenlignet med normale ikke-transplanterede nyrer (figur 2).
Vi har tidligere undersøgt resultatet af denne nye knudeløse teknik (n = 175) og sammenlignet den med den klassiske tilgang (n = 122) med hensyn til tekniske aspekter af proceduren og intraoperative og postoperative komplikationer (se også tabel 1)10. Den modificerede teknik, der er vist her, var forbundet med en lavere forekomst af intragraftarterielle eller venøse trombotiske hændelser (figur 3b, 1,1% versus 6,6%). Tiden til at udføre anastomosen var signifikant mindre (figur 3a), og der blev opnået en meget reproducerbar nyretransplantat på lang sigt (95 % versus 84 %, p < 0,001, figur 3c) som bestemt af modtagerens overlevelse 12 uger efter transplantationen. Desuden påvirker anvendelsen af denne modificerede transplantationsprocedure ikke nyreallograftfunktionen som vurderet ved serumkreatinin i observationsperioden på 12 uger10.
| Konventionel | Ny knudeløs teknik | |
| (n=122) | (n=175) | |
| Driftstider | ||
| Tid til arteriel anastomose (min) | 9.2 ± 0.09 | 7,5 ± 0,06** |
| Tid til venøs anastomose (min) | 9.1 ± 0.10 | 7,5 ± 0,05** |
| Komplikationsrater | ||
| Trombose | 8 (6.6%) | 2 (1,1 %)* |
| Lokal blødning | 4 (3.3%) | 1 (0.6%) |
| Succesrate | 103 (84.4%) | 167(95.4%)** |
| Rong,S., Lewis AG., Kunter U., et al. En knudeløs teknik til nyretransplantation i musen. J Transplantation. Epub2012:127215,(2012). | ||
Tabel 1: Sammenligning af denne nye teknik (n = 175) med den konventionelle teknik (n = 122) med hensyn til tekniske aspekter af proceduren og intraoperative og postoperative komplikationer10. Tal repræsenterer driftstiderne i minutter for hver procedure (gennemsnit ± SD).
Figur 1: Repræsentative histologiske resultater, der vurderer rørformet atrofi. HE Farvning af nyretransplantationer 4 uger efter transplantation (40x): (a) normal ikke-transplanteret nyre, (b) konventionel teknik og (c) modificeret teknik til en syngeneisk nyretransplantation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative histologiske resultater, der vurderer interstitiel fibrose. Masson Goldners trikromfarvning 12 uger efter transplantation (40x) af (a) normal ikke-transplanteret nyre, (b) konventionel teknik og (c) modificeret teknik til en syngeneisk nyretransplantation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Sammenligning af driftstider for fartøjsanastomoser, hyppighed af komplikationer og succesrater mellem den modificerede og den konventionelle teknik10 Bargraferne i (a) viser den driftstid, der er nødvendig for at udføre fartøjets anastomose; bargraferne i litra b) viser intragrafttrombosehændelser og lokale blødningsproblemer mens bargraferne i (c) viser en højere succesrate for den nye knudeløse teknik i henhold til overlevelsen større end 12 uger eftertransplantation efter yderligere udplantning af den oprindelige kontralaterale nyre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Oversigt over den anatomiske struktur (øvre paneler a og b) og resektionslinjer i aorta og nyrearterien for både den konventionelle (c) og den modificerede teknik (d). (A) Abdominal aorta, (B) Nyrearterie, (C) Ureteral arterie, (D) Nyre, (E) Ureter. De venøse kar (V. cava, herunder Vv. renales) er afbildet som prikkede linjer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Eksemplarisk demonstration af en knudeløs syning af arteriekaret anastomose , der viser (A) abdominal aorta, (B) nyrearterien og (C) den knudeløse syningteknik, hvor anastomosens sidste sting ikke er bundet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Anastomose af donorurelederen med modtagerens urinblære. a) trænge igennem modtagerens urinblære med et 10/0 monofilament og indsætte det i en 21 G-nåles lumen, b) lede 21 G-nålen til at udføre et hul placeret ved den forrige nåleperforering, c) trække 21 G-nålen ud, d) sy den trimmede urinlederende med 10/0-suturen og perforere blæren med 10/0-suturen igen på indgangsstedet, e) derefter trække 10/0-suturen og urinlederen ind i urinblæren gennem det konstruerede hul, f) og anastomose donorens urinleder til modtagerens blære med yderligere 10/0 sutur. Til sidst skal du trække trækkraftsuturen ud. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens hudtransplantationsmodellen hos mus er enkel og nem at udføre for at studere alloimmune afvisningshændelser, har de kirurgiske teknikker til mere specifikt at undersøge de alloimmunrelaterede inflammatoriske ændringer efter hjerte16 og nyretransplantation10 vist sig at være komplekse og meget krævende. Fra transplantationsnepsebustens synspunkt har etableringen af en effektiv og langsigtet stabil musenyretransplantationsmodel stadig en uerstattelig betydning for mange funktionelle og immunologiske undersøgelser. Derudover kan musenyretransplantationsmodellen sammenlignet med andre organtransplantationer opnå en langvarig overlevelse selv med visse forskelle i større histokompatibilitetsantigener, hvilket indebærer muligheden for at studere immunreguleringsmekanismer i den langsigtede udvikling af både afvisning eller identifikation af forudsætningsfaktorer for at etablere alloimmuntolerance3.
Som tidligere beskrevet er nyretransplantation hos mus en udfordrende procedure, og succesraten for selv erfarne kirurger varierer meget mellem 40 og 95%10,17,18,19,20. Med hensyn til rapporter fra forskellige forskerhold rundt om i verden om denne kirurgiske teknik har vi foretaget følgende ændringer i forhold til den klassiske tilgang, der fører til flere forbedringer.
For det første skæres en plet af abdominal aorta og forberedes således, at de proksimale bifurkationer af nyrearterien og urinrørsarterien transekteres, herunder donornyre en bloc. Denne manøvre bevarer og bevarer ikke kun blodforsyningen og funktionen af donorens urinleder ved at undgå en skade på det periureterale væv og dermed forhindre en postoperativ hydronephrose, men det forhindrer også postoperative strikturer i nyrearterien (figur 4). Derfor undgås nyretransplantationsiskæmi medieret af en striktur i nyrearterien eller forårsaget af en hydronephrose medieret af en streng og iskæmisk transplantationsurleder, hvilket repræsenterer to af de vigtigste aspekter for at opnå den langsigtede transplantationsoverlevelse i denne model. Der er dog anatomiske varianter for afkom af ureteral arterie. For eksempel stammer urinarterien i nogle mus fra hovedstammen i abdominal aorta i stedet for nyrearterien, og placeringen af dette afkom er for det meste ca. 0,2 til 0,5 mm distal fra nyrearteriens afkom (afbildet i figur 4). Ud fra vores erfaring ville vi estimere forekomsten af urinlederarterien, der stammer direkte fra aorta hos ca. 20% af C57BL/6J hanmus (upubliceret observation) og mere sjældent i andre stammer af mus som BALBc. I nogle af de rapporterede traditionelle kirurgiske metoder blev dette vigtige næringsfartøj undertiden forsømt at beskytte, da det blev ignoreret og direkte ligeret eller elektrocauteret.
Især i disse situationer med anatomiske varianter, når afkom af musens ureterale arterie stammer fra hovedstammen af abdominal aorta under afkom af nyrearterien, er denne metode til en bloc transektion og rekonstruktion af aorta anastomose endnu mere egnet. Erfarne kirurger kan endda beslutte, hvornår de skal bruge den traditionelle eller modificerede en bloc anastomose.
For det andet giver anvendelsen af en ny, enkel og hurtig teknik til en knudeløs vaskulær anastomose, hvor den endelige søm af anastomose ikke er bundet med enden af det øvre slips som den traditionelle tilgang, men forbliver fri i stedet, en værdifuld fordel (se figur 5). Denne teknik gør det stadig muligt at øge eller formindske størrelsen af anastomosen, efter at nyretransplantationsreperfusion allerede er påbegyndt. Dette undgår udviklingen af karstrikturer og intraabdominal blødning. Derudover kan de frie haler af forankringsstingene i begge ender trækkes i modsatte retninger for fleksibelt at justere og udvide anastomosen for at undgå stenose i arterierne eller venerne. Syningsteknikken forbedrer derfor kirurgiens fejltolerancerate og er venlig for nybegyndere20.
For det tredje blev 21 G og 30 G sprøjtenåle anvendt som hjælpepunkturrestyreværktøjer til atraumatisk udførelse af anastomosen i donorureureturet og modtagerblæren. Hos mus er urinlederen ret tynd og meget delikat til at udføre en ende-til-ende anastomose. Normalt trækkes donoruretlederen direkte ind i blæren ved hjælp af tang til at styre urinlederen efter perforering af blæren med en sprøjtenål. Vi har yderligere forbedret denne metode ved hjælp af en tyndere diameter 30 G sprøjtenål som vejledning til 21 G sprøjtenålen (Seldinger-proceduren). Med denne atraumatiske teknik trænger 21 G sprøjtenålen ikke ind i hele blæren, hvilket reducerer skaden på blæren og vanskeligheden ved ureteral implantation17 (supplerende figur 1).
Et kritisk trin i protokollen er konfigurationen af arterieåbningen. I begge tilfælde (donor og modtager) skal disse skæres pænt, ellers vil det påvirke anastomosens kvalitet. Desuden er den sidste søm i denne nye knudeløse teknik ikke bundet til den knyttede tråd. Efter anastomose skal kirurgen i første omgang holde den anastomotiske stomi lille. Træk derefter trådens ender i de øvre og nedre ender efter reperfusion for at forstørre den. Et andet kritisk skridt, som man skal være opmærksom på, er placeringen af snittet i donorens nyrearterie, da urinlederarterien skal identificeres for at blive beskyttet.
En væsentlig begrænsning ved denne teknik er - udover de beskrevne forbedringer - at operatøren stadig skal opfylde høje krav, da fartøjets vægge er små og meget møre. Uden intens og vedholdende praksis vil succesraten for operationen være lav.
Sammenfattende viser denne rapport anvendeligheden af en teknisk ændring af nyretransplantationsproceduren hos mus. Den kirurgiske procedure, der præsenteres her, har vist sig at være en værdifuld og pålidelig metode, der fungerede som en væsentlig komponent i flere forskningspublikationer inden for de sidste 10 år 3,19,20. I forhold til den klassiske og bredt etablerede kirurgiske model giver den metode, der er demonstreret her, flere vigtige forbedringer, der fører til mindre komplikationsrater og en længere transplantationsoverlevelsesrate i den syngeneiske nyretransplantationsindstilling3. Det er vigtigt at nævne, at begge teknikker (modificerede og konventionelle) deler de samme yderligere komplikationer, der påvirker modtagerens dødelighed, såsom at være ved at gå ned ved visceral skade, lækage af urin, hydronephrose, infektioner osv., Som ikke var forskellige. Sammenfattende forbedrer denne nye kirurgiske teknik den samlede succesrate og langsigtede graftoverlevelse, hvilket gør det til et pålideligt værktøj til at studere det alloimmune respons efter nyretransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Tiantian Bai-teamet for hjælp med voice over, frøken Mian Pao for hendes hjælp med medicinsk illustration. Dette arbejde blev delvist støttet af den tyske forskningsfond (DFG) for at fremme internationale samarbejder (HO2581/4-1 til AH) og National Science Foundation of China (NSFC; #81760291 til FJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | - |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | - |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | - |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | - |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | - |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | - |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | - |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | - |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | - |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | - |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | - |
| Dehydrator | DIAPATH | Donatello | - |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | - |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | - |
| Ethanol | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 100092683 | - |
| Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | - |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | - |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | - |
| HE dye solution set | Servicebio | G1003 | - |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | - |
| hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | - |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | - |
| ice box | PETZ | No Catalog Number available | - |
| Imaging system | Nikon | Nikon DS-U3 | - |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | - |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | - |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | - |
| Masson dye solution set | Servicebio | G1006 | - |
| metamizole | WDT | no catalog numer | - |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | - |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | - |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | - |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | - |
| Neutral gum | SCRC | 10004160 | - |
| Oven | Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd | GFL-230 | - |
| Pathology slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | - |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | - |
| scissors | Peha Instruments | 991083/4 | - |
| Slides | Servicebio | - | |
| small Petri dish | Sarstedt | 8,33,900 | - |
| straight forceps | WPI | 14113-G | - |
| surgical tape | BSN | 4120 | - |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | - |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | - |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | - |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | - |
| Syringe (0,3 mL) | BD | 324826 | - |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | - |
| Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd | KD-P | - |
| Upright optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse E100 | - |
| xylazine | Bayer | Rompun | - |
| Xylene | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 10023418 | - |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplantation Proceedings. 5 (1), 721-725 (1973).
- Jiang, K., et al. Noninvasive assessment of renal fibrosis with magnetization transfer MR imaging: Validation and evaluation in murine renal artery stenosis. Radiology. 283 (1), 77-86 (2017).
- Tse, G. H., et al. Mouse kidney transplantation: Models of allograft rejection. Journal of Visualized Experiments. (92), e52163 (2014).
- Okazaki, M., et al. et al.Costimulatory blockade-mediated lung allograft acceptance is abrogated by overexpression of Bcl-2 in the recipient. Transplantation Proceedings. 41 (1), 385-387 (2009).
- Chuck, N. C., et al. et al.Ultra-short echo-time magnetic resonance imaging distinguishes ischemia/reperfusion injury from acute rejection in a mouse lung transplantation model. Transplant International. 29 (1), 108-118 (2016).
- Zhang, Z., et al. Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations. Transplantation. 62 (9), 1267-1272 (1996).
- Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A.
- Plenter, R., Jain, S., Ruller, C. M., Nydam, T. L., Jani, A. H.
- Plenter, R. J., Jain, S., Nydam, T. L., Jani, A. H. Revised arterial anastomosis for improving murine kidney transplant outcomes. Journal of Investigative Surgery. 28 (4), 208-214 (2015).
- Rong, S., Lewis, A. G., Kunter, U., Haller, H., Gueler, F. A knotless technique for kidney transplantation in the mouse. Journal of Transplantation. , 127215 (2012).
- Kreimann, K., et al. Ischemia reperfusion injury triggers CXCL13 release and B-cell recruitment after allogenic kidney transplantation. Frontiers in Immunology. 11, 1204 (2020).
- Schmidbauer, M., et al. Diffusion-Weighted imaging and mapping of T1 and T2 relaxation time for evaluation of chronic renal allograft rejection in a translational mouse model. Journal of Clinical Medicine. 10 (19), 4318 (2021).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Haas, M. Chronic allograft nephropathy or interstitial fibrosis and tubular atrophy: what is in a name. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (3), 245-250 (2014).
- Dang, Z., MacKinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3. Transplantation. 93 (5), 477-484 (2012).
- Yin, D., et al. Blood circuit reconstruction in an abdominal mouse heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (172), e62007 (2021).
- Zhang, Z., et al. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16 (2), 103-109 (1995).
- Mannon, R. B., et al. Chronic rejection of mouse kidney allografts. Kidney International. 55 (5), 1935-1944 (1999).
- Coffman, T., et al. Improved renal function in mouse kidney allografts lacking MHC class I antigens. Journal of Immunology. 151 (1), 425-435 (1993).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
