Etiketfri ikke-lineær optik til undersøgelse af tubulinafhængige defekter i central myelin

Summary

I denne artikel præsenterer vi en protokol til påvisning af mikrotubulusbelastede oligodendrocytter i en model af tubulinopati gennem en simpel, innovativ anden harmonisk generations mikroskopi-tilgang.

Abstract

Den tilfredsstillende visualisering af cytoskeletale komponenter i hjernen er udfordrende. Den allestedsnærværende fordeling af netværkene af mikrotubuli, mikrofilamenter og mellemliggende filamenter i alle neurale væv sammen med variabiliteten i resultaterne af fluorescerende proteinfusionsstrategier og deres begrænsede anvendelighed til dynamiske undersøgelser af antistoffer og lægemidler som kromoforkøretøjer gør klassiske optiske tilgange ikke så effektive som for andre proteiner. Når tubulin skal undersøges, er den etiketfrie generering af anden harmonisk en meget passende mulighed på grund af molekylets ikke-centrosymmetriske organisation. Denne teknik, når den konjugeres til mikroskopi, kan kvalitativt beskrive den volumetriske fordeling af parallelle bundter af mikrotubuli i biologiske prøver med den yderligere fordel at arbejde med friske væv, der er ufikserede og upermeabiles. Dette arbejde beskriver, hvordan man afbilder tubulin med en kommerciel anden harmonisk generations mikroskopiopsætning for at fremhæve mikrotubuli i de tubulinberigede strukturer af oligodendrocytterne, som i hypomyelinering med atrofi af basalganglierne og cerebellum (H-ABC) tubulinopati, en nyligt beskrevet myelinforstyrrelse.

Introduction

Den optiske billeddannelse af cytoskeletale strukturer i væv og organpræparater er ikke en nem opgave. Cytoskeletale filamenter er allestedsnærværende, så hvis generisk farvning udføres, for eksempel mod alfa-tubulin eller beta-actin eller potentielt keratin i en epitelprøve, vil signalet sandsynligvis blive fordelt ret homogent over hele prøven. For at begrænse farvningen til en mere meningsfuld delmængde af cellulære komponenter kan man enten bruge transgene mus med målrettet ekspression¹ eller planlægge at bruge isoformspecifikke antistoffer. Mens meget få af sidstnævnte er på markedet (og meget få findes overhovedet ^2,3,4), kan en transgen dyremodel være tilgængelig. Det skal dog erhverves af laboratoriet og have det ordentligt til huse med alle de udgifter, der er involveret i processen. Visse antistoffer eller kemikalier, f.eks. fluoroforkonjugerede lægemidler som phalloidin eller paclitaxel, kan være helt eller delvist uforenelige med anvendelse i levende celler eller væv, hvilket begrænser deres anvendelighed til kun at omfatte undersøgelser af faste prøver.

I tilfælde af tubulin skal der tages hensyn til et yderligere aspekt, som er polymerens følsomhed over for fiksering. Konventionel kemisk fiksering med formaldehyd er kendt for ikke at være tilstrækkelig til optimalt at bevare integriteten af mikrotubuli⁵. Derudover bekræfter en nylig rapport, at formaldehydtværbinding inducerer subtile ændringer i mikrotubuliens ultrastruktur, svarende til hvad der sker med bindingen af nogle lægemidler eller fysiologiske molekyler såsom GTP⁶.

Den direkte visualisering af mikrotubuli i ufarvede, ikke-fikserede prøver er derfor ofte ønskelig. For at opnå dette er en teknisk løsning anden harmonisk generation (SHG) mikroskopi⁷, som er baseret på evnen af bundter af parallelle mikrotubuli til at fungere som harmonoforer og udsende frekvensfordoblet lys, når det belyses korrekt med en intens, pulserende infrarød laser. Selvom et stærkere og mere stabilt andet harmonisk signal kan genereres fra kollagen og myosin, som er de eneste to andre biologiske materialer, der vides at være i stand til frekvensfordobling, er signalet fra tubulin hidtil blevet brugt mest til at studere mitotiske spindelomlægninger ^8,9,10 og aksonal mikrotubulusmorfologi^11,12,13.

I dette arbejde introducerer vi en ny anvendelse af SHG-mikroskopi som et diagnostisk værktøj til at skelne centralnervesystem (CNS) væv, der er påvirket af tubulin beta 4 A (TUBB4A) tubulinopati fra deres raske modstykker¹⁴. Nogle af de mutationer, der forekommer i denne overvejende neurale isoform af tubulin, som dem, der forårsager hypomyelinering og atrofi af de basale ganglier og cerebellum (H-ABC), inducerer mikrotubulusoverfyldning i oligodendrocytterne^15,16; De cytoskeletale ændringer er igen forbundet med nedstrøms effekter som dysmyelinisering, med dyb svækkelse af de motoriske og sensoriske veje^16,17,18,19. Taiep-murinmodellen, der anvendes i dette arbejde, viser unormalt mikrotubulusindhold i oligodendrocytterne og rekapitulerer de fleste af de sensorisk-motoriske symptomer hos H-ABC-patienter¹⁷. Protokollen forklarer, hvordan man afbilder strukturer som corpus callosum og cerebellum, som normalt er stærkt myelinerede, og som er alvorligt påvirket hos humane patienter såvel som hos taiep rotte¹⁹, for at fremhæve forskellene i SH-signaler mellem sundt og mutant væv.

Protocol

Alle beskrevne procedurer blev udført i overensstemmelse med de love og koder, der er godkendt i den syvende titel i forordningen om den mexicanske regerings generelle sundhedslov vedrørende sundhedsforskning (NOM-062-ZOO-1999) og i overensstemmelse med anbefalingerne fra National Institutes of Health Guide for pleje og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af det institutionelle udvalg for bioetik i forskning ved Universidad de Guanajuato og Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. <stron…

Representative Results

Billederne opnået med denne metode har et iboende lavt baggrundsniveau på grund af det meget begrænsede antal harmonoforer, der er til stede i biologiske væv, hvilket er en af de væsentlige fordele ved metoden. Når fibrene i corpus callosum er afbildet, kan fiberlignende korte strukturer og afrundede elementer konsekvent findes i taiephjernen (figur 3B), mens corpus callosum i kontrolhjernen viser et meget mere heterogent og isotropt signal i hele hjerneområdet (<strong class="…

Discussion

SHG-mikroskopi er en del af en gruppe af ikke-lineære optiske teknikker, som omfatter to-foton excitationsmikroskopi, tredje harmonisk generationsmikroskopi og sammenhængende anti-Stokes Raman-spredningsmikroskopi, der har bidraget til at udvide anvendelsesområdet for konventionel optisk mikroskopi til biovidenskab²⁰.

Specifikt vedrører den største styrke og svaghed ved SHG-mikroskopi den samme tilstand: signalgeneratoren er ikke-centrosymmetrisk^2…

Materials

405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200