중심 미엘린의 튜불린 의존성 결함 연구를 위한 무표지 비선형 광학
Summary
이 기사에서는 간단하고 혁신적인 2차 고조파 생성 현미경 접근 방식을 통해 세뇨관병증 모델에서 미세소관 로딩 희소돌기아교세포를 검출하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
뇌의 세포 골격 구성 요소를 만족스럽게 시각화하는 것은 어려운 일입니다. 모든 신경 조직에서 미세소관, 미세필라멘트 및 중간 필라멘트 네트워크의 유비쿼터스 분포와 형광 단백질 융합 전략의 결과의 가변성 및 발색단 비히클로서의 항체 및 약물의 동적 연구에 대한 제한된 적용 가능성으로 인해 고전적인 광학 접근 방식은 다른 단백질만큼 효과적이지 않습니다. 튜 불린을 연구해야 할 때, 2 차 고조파의 표지없는 생성은 분자의 비 중심 대칭 조직으로 인해 매우 적합한 옵션입니다. 이 기술은 현미경에 접합 될 때 생물학적 샘플에서 평행 한 미세 소관 다발의 체적 분포를 정 성적으로 설명 할 수 있으며 고정되지 않고 투과되지 않은 신선한 조직으로 작업 할 수있는 추가적인 이점이 있습니다. 이 연구는 최근에 기술된 미엘린 장애인 기저핵 및 소뇌(H-ABC) 세뇨관 병증의 위축을 동반한 저수초화에서와 같이 희소돌기아교세포의 튜불린이 풍부한 구조에서 미세소관을 강조하기 위해 상업용 2차 고조파 생성 현미경 설정으로 튜불린을 이미지화하는 방법을 설명합니다.
Introduction
조직 및 장기 준비에서 세포 골격 구조의 광학 이미징은 쉬운 일이 아닙니다. 세포골격 필라멘트는 어디에나 있으므로 예를 들어 상피 샘플의 알파-튜불린 또는 베타-액틴 또는 잠재적으로 케라틴에 대해 일반적인 염색을 수행하는 경우 신호는 샘플 전체에 다소 균일하게 분포될 수 있습니다. 염색을 세포 성분의 보다 의미 있는 하위 집합으로 제한하기 위해, 표적 발현1을 갖는 형질전환 마우스를 사용하거나 이소형 특이적 항체를 사용할 계획을 세울 수 있다. 후자 중 극소수가 시장에 나와 있지만(2,3,4에는 거의 존재하지 않음) 형질전환 동물 모델을 사용할 수 있습니다. 그러나 실험실에서 구입하여 프로세스에 관련된 모든 비용과 함께 적절하게 보관해야 합니다. 특정 항체 또는 화학 물질, 예를 들어 팔로이딘 또는 파클리탁셀과 같은 형광단 접합 약물은 살아있는 세포 또는 조직에서의 사용과 부분적으로 또는 완전히 양립할 수 없으므로 고정 샘플에 대한 연구에만 적용할 수 있습니다.
튜 불린의 경우, 고정에 대한 폴리머의 민감도 인 추가 측면을 고려해야합니다. 포름 알데히드에 의한 종래의 화학적 고정은 미세 소관의 완전성을 최적으로 보존하기에 적합하지 않은 것으로 알려져 있습니다5. 또한 최근 보고서에 따르면 포름 알데히드 가교는 GTP6과 같은 일부 약물 또는 생리 학적 분자의 결합에서 발생하는 것과 유사하게 미세 소관의 미세 구조에 미묘한 변화를 유도합니다.
따라서 염색되지 않고 고정되지 않은 샘플에서 미세소관을 직접 시각화하는 것이 종종 바람직합니다. 이를 달성하기 위한 한 가지 기술적 솔루션은 2차 고조파 생성(SHG) 현미경7로, 이는 병렬 미세소관 다발이 하모노포어 역할을 하고 강렬한 펄스 적외선 레이저로 적절하게 조명될 때 주파수 이중 빛을 방출하는 능력을 기반으로 합니다. 더 강력하고 안정적인 2차 고조파 신호가 주파수 배가가 가능한 것으로 알려진 유일한 다른 두 가지 생물학적 물질인 콜라겐과 미오신에서 생성될 수 있지만, 튜불린의 신호는 지금까지 주로 유사분열 방추 재배열 8,9,10 및 축삭 미세소관 형태 11,12,13을 연구하는 데 사용되었습니다.
이 연구에서 우리는 튜불린 베타 4 A (TUBB4A) 세뇨관 병증의 영향을받는 중추 신경계 (CNS) 조직을 건강한 대응물 14와 구별하기위한 진단 도구로서 SHG 현미경의 새로운 사용을 소개합니다. 기저핵과 소뇌 (H-ABC)의 저 수초화 및 위축을 유발하는 것과 같은이 주로 신경 이형 튜 불린에서 발생하는 돌연변이 중 일부는 희소 돌기 아교 세포에서 미세 소관 과충진을 유도합니다15,16; 세포 골격 변화는 차례로 운동 및 감각 경로16,17,18,19의 심오한 손상과 함께 수초화와 같은 하류 효과와 관련이 있습니다. 이 작업에 사용 된 taiep 쥐 모델은 희소 돌기 아교 세포에서 비정상적인 미세 소관 함량을 표시하고 H-ABC 환자17의 감각 운동 증상의 대부분을 요약합니다. 이 프로토콜은 건강한 조직과 돌연변이 조직 간의 SH 신호의 차이를 강조하기 위해 일반적으로 고도로 수초화되고 인간 환자와 taiep rat 19에서 심하게 영향을받는 뇌량과 소뇌로 구조를 이미지화하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SHG 현미경은 2광자 여기 현미경, 3차 고조파 생성 현미경 및 응집성 안티-스톡스 라만 산란 현미경을 포함하는 비선형 광학 기술 그룹의 일부로, 종래의 광학 현미경의 적용 범위를 생명 과학(20)으로 확장하는 데 기여했습니다.
특히, SHG 현미경의 주요 강점과 약점은 동일한 조건과 관련이 있습니다 : 신호 발생기는 비 중심 대칭21입니다. 이?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT)의 지원을 받아 다음과 같은 보조금을 받았습니다: VP-CIO에게 infraestructura 226450, VP에게 infraestructura 255277, FORDECYT-PRONACES/194171/2020에서 V.H.로 우리는 비디오 제작에서 CIO의 Juvenal Hernández Guevara의 지원을 인정합니다.
Materials
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
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