Summary

Óptica no lineal sin etiquetas para el estudio de defectos dependientes de tubulina en mielina central

Published: March 24, 2023
doi:

Summary

En este artículo, presentamos un protocolo para detectar oligodendrocitos cargados de microtúbulos en un modelo de tubulinopatía a través de un enfoque simple e innovador de microscopía de segunda generación armónica.

Abstract

La visualización satisfactoria de los componentes citoesqueléticos en el cerebro es un desafío. La distribución ubicua de las redes de microtúbulos, microfilamentos y filamentos intermedios en todos los tejidos neurales, junto con la variabilidad en los resultados de las estrategias de fusión de proteínas fluorescentes y su aplicabilidad limitada a estudios dinámicos de anticuerpos y fármacos como vehículos cromóforos, hacen que los enfoques ópticos clásicos no sean tan efectivos como para otras proteínas. Cuando la tubulina necesita ser estudiada, la generación sin etiqueta de segundos armónicos es una opción muy adecuada debido a la organización no centrosimétrica de la molécula. Esta técnica, cuando se conjuga con microscopía, puede describir cualitativamente la distribución volumétrica de haces paralelos de microtúbulos en muestras biológicas, con la ventaja adicional de trabajar con tejidos frescos que no están fijados ni permeabilizados. Este trabajo describe cómo obtener imágenes de la tubulina con una configuración comercial de microscopía de segunda generación armónica para resaltar los microtúbulos en las estructuras enriquecidas con tubulina de los oligodendrocitos, como en la hipomielinización con atrofia de los ganglios basales y la tubulinopatía del cerebelo (H-ABC), un trastorno de mielina descrito recientemente.

Introduction

La obtención de imágenes ópticas de estructuras citoesqueléticas en tejidos y preparaciones de órganos no es una tarea fácil. Los filamentos citoesqueléticos son ubicuos, por lo que si se realiza una tinción genérica, por ejemplo, contra alfa-tubulina o beta-actina o potencialmente queratina en una muestra epitelial, la señal probablemente se distribuirá de manera bastante homogénea en toda la muestra. Para restringir la tinción a un subconjunto más significativo de componentes celulares, se pueden usar ratones transgénicos con expresión dirigida1 o planear usar anticuerpos específicos de isoforma. Si bien muy pocos de estos últimos están en el mercado (y muy pocos existen en absoluto 2,3,4), un modelo animal transgénico podría estar disponible. Sin embargo, debe ser adquirido por el laboratorio y alojado adecuadamente, con todos los gastos involucrados en el proceso. Ciertos anticuerpos o productos químicos, por ejemplo, fármacos conjugados con fluoróforos como la faloidina o el paclitaxel, pueden ser parcial o totalmente incompatibles con el uso en células o tejidos vivos, lo que limita su aplicabilidad solo a estudios de muestras fijas.

En el caso de la tubulina, se debe tener en cuenta un aspecto adicional, que es la sensibilidad del polímero a la fijación. La fijación química convencional con formaldehído es conocida por no ser adecuada para preservar de manera óptima la integridad de los microtúbulos5. Además, un informe reciente confirma que la reticulación de formaldehído induce cambios sutiles en la ultraestructura del microtúbulo, similar a lo que sucede con la unión de algunos fármacos o moléculas fisiológicas como GTP6.

La visualización directa de microtúbulos en muestras no teñidas y no fijadas es, por lo tanto, a menudo deseable. Para lograr esto, una solución técnica es la microscopía7 de segunda generación armónica (SHG), que se basa en la capacidad de los haces de microtúbulos paralelos para actuar como armonóforos y emitir luz duplicada en frecuencia cuando se iluminan adecuadamente con un láser infrarrojo intenso y pulsado. Aunque se puede generar una segunda señal armónica más fuerte y estable a partir del colágeno y la miosina, que son los únicos otros dos materiales biológicos conocidos por ser capaces de duplicar la frecuencia, la señal de la tubulina se ha utilizado hasta ahora principalmente para estudiar los reordenamientos del huso mitótico 8,9,10 y la morfología de los microtúbulos axonales11,12,13.

En este trabajo, presentamos un uso novedoso de la microscopía SHG como herramienta de diagnóstico para distinguir los tejidos del sistema nervioso central (SNC) afectados por la tubulinopatía por tubulina beta 4 A (TUBB4A) de sus contrapartes sanas14. Algunas de las mutaciones que ocurren en esta isoforma predominantemente neural de tubulina, como las que causan hipomielinización y atrofia de los ganglios basales y cerebelo (H-ABC), inducen el sobrellenado de microtúbulos en los oligodendrocitos15,16; Las alteraciones citoesqueléticas, a su vez, están asociadas con efectos posteriores como la desmielinización, con un profundo deterioro de las vías motoras y sensoriales16,17,18,19. El modelo murino taiep utilizado en este trabajo muestra un contenido anormal de microtúbulos en los oligodendrocitos y recapitula la mayoría de los síntomas sensorio-motores de los pacientes con H-ABC17. El protocolo explica cómo visualizar estructuras como el cuerpo calloso y el cerebelo, que generalmente están altamente mielinizadas y que se ven gravemente afectadas en pacientes humanos, así como en la rata taiep 19, para resaltar las diferencias en las señales de SH entre tejidos sanos y mutantes.

Protocol

Todos los procedimientos descritos se realizaron en cumplimiento con las leyes y códigos aprobados en el título séptimo del Reglamento de la Ley General de Salud en Investigación en Salud del Gobierno de México (NOM-062-ZOO-1999) y de acuerdo con las recomendaciones de la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación y fueron aprobados por el comité institucional de bioética en investigación de la Universidad de Guanajuato y la Benemérita Universidad Autónoma …

Representative Results

Las imágenes obtenidas con esta metodología tienen un nivel de fondo intrínsecamente bajo debido al número muy limitado de armonóforos presentes en los tejidos biológicos, que es una de las ventajas significativas del método. Cuando se obtienen imágenes de las fibras del cuerpo calloso, se pueden encontrar consistentemente estructuras cortas similares a fibras y elementos redondeados en el cerebro taiep (Figura 3B), mientras que el cuerpo calloso del cerebro control muestra un…

Discussion

La microscopía SHG forma parte de un grupo de técnicas ópticas no lineales, que incluyen microscopía de excitación de dos fotones, microscopía de tercera generación armónica y microscopía de dispersión Raman anti-Stokes coherente, que han contribuido a ampliar la gama de aplicaciones de la microscopía óptica convencional a las ciencias de la vida20.

Específicamente, la mayor fortaleza y debilidad de la microscopía SHG se relaciona con la misma condición: …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) a través de las siguientes subvenciones: infraestructura 226450 a VP-CIO, infraestructura 255277 a V.P., y FORDECYT-PRONACES/194171/2020 a V.H. Reconocemos el apoyo de Juvenal Hernández Guevara en CIO en la realización del video.

Materials

405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter  Semrock FF01-405/10-25 32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric Thorlabs BK5 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick 
Blades for vibratome any commercial; e.g. Wilkinson Sword  Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm any commercial; e.g. Falcon 351008
Confocal microscope Zeiss LSM710NLO AxioObserver Z1 Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA 
Cooler any commercial Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach e.g. Maizena From the supermarket
Coverslips #1.5 any commercial Rectangular
Cyanoacrylate glue e.g. Loctite To glue the brain to the masking tape
Fine forceps fine science tools 11412-11 To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors fine science tools 14370-22 To cut the skin 
Fine scissors curved tip fine science tools 14061-09 To cut along the midline
Formaldehyde 37% Sigma-Aldrich 252549 To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur fine science tools 16000-14 To cut the bone
Gel packs any commercial Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified any commercial To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) Gibco 14025-076 Could be prepared from powders
Kelly hemostats fine science tools 13018-14 To separate the bone 
Masking tape any commercial To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C Zeiss 000000-1410-101 To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers fine science tools 16101-10 To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010-031 Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser Coherent Chameleon Vision II 680–1080 nm tunable laser
Scalpel any commercial Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps fine science tools 11000-18
Vannas spring scissors fine science tools 15018-10 To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome any commercial; e.g. Leica VT1200

References

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Piazza, V., Alata, M., Hernandez, V. H., Eguibar, J. R., Cortes, C. Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin. J. Vis. Exp. (193), e63449, doi:10.3791/63449 (2023).

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