Merkezi Miyelin'de Tubuline Bağlı Kusurların İncelenmesi için Etiketsiz Doğrusal Olmayan Optikler
Summary
Bu makalede, basit, yenilikçi bir ikinci harmonik nesil mikroskopi yaklaşımı ile bir tübülinopati modelinde mikrotübül yüklü oligodendrositleri tespit etmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Beyindeki sitoiskelet bileşenlerinin tatmin edici bir şekilde görselleştirilmesi zordur. Tüm sinir dokularında mikrotübüller, mikrofilamentler ve ara filamentlerin ağlarının her yerde bulunması, floresan protein füzyon stratejilerinin sonuçlarındaki değişkenlik ve bunların kromofor araçları olarak antikorların ve ilaçların dinamik çalışmalarına sınırlı uygulanabilirliği ile birlikte, klasik optik yaklaşımları diğer proteinler kadar etkili kılmamaktadır. Tubulinin incelenmesi gerektiğinde, ikinci harmoniklerin etiketsiz üretimi, molekülün merkez-simetrik olmayan organizasyonu nedeniyle çok uygun bir seçenektir. Bu teknik, mikroskopiye konjuge edildiğinde, biyolojik örneklerdeki paralel mikrotübül demetlerinin hacimsel dağılımını, sabitlenmemiş ve geçirgenleşmemiş taze dokularla çalışmanın ek avantajıyla niteliksel olarak tanımlayabilir. Bu çalışma, yakın zamanda tanımlanmış bir miyelin bozukluğu olan bazal gangliyon ve serebellum (H-ABC) tübülinopatisinin atrofisi ile hipomiyelinasyonda olduğu gibi, oligodendrositlerin tübülinle zenginleştirilmiş yapılarındaki mikrotübülleri vurgulamak için ticari bir ikinci harmonik nesil mikroskopi kurulumuyla tübülinin nasıl görüntüleneceğini açıklamaktadır.
Introduction
Dokulardaki ve organ preparatlarındaki sitoiskelet yapılarının optik olarak görüntülenmesi kolay bir iş değildir. Sitoiskelet filamentleri her yerde bulunur, bu nedenle jenerik boyama yapılırsa, örneğin, bir epitel örneğinde alfa-tübülin veya beta-aktin veya potansiyel olarak keratine karşı, sinyal muhtemelen numunenin her tarafına homojen bir şekilde dağıtılacaktır. Boyama işlemini hücresel bileşenlerin daha anlamlı bir alt kümesiyle sınırlamak için, hedeflenen ekspresyon1 ile transgenik fareler kullanılabilir veya izoforma özgü antikorlar kullanmayı planlayabilir. İkincisinin çok azı piyasada olsa da (ve çok azı 2,3,4’te mevcut), transgenik bir hayvan modeli mevcut olabilir. Bununla birlikte, laboratuvar tarafından satın alınması ve sürece dahil olan tüm masraflarla birlikte uygun şekilde barındırılması gerekir. Bazı antikorlar veya kimyasallar, örneğin, faloidin veya paklitaksel gibi florofor konjuge ilaçlar, canlı hücrelerde veya dokularda kullanımla kısmen veya tamamen uyumsuz olabilir, bu nedenle uygulanabilirliklerini yalnızca sabit numunelerin çalışmalarına sınırlandırır.
Tübülin durumunda, polimerin fiksasyona duyarlılığı olan ek bir husus dikkate alınmalıdır. Formaldehit ile konvansiyonel kimyasal fiksasyonun, mikrotübüllerin bütünlüğünü en iyi şekilde korumak için yeterli olmadığı bilinmektedir5. Ek olarak, yakın tarihli bir rapor, formaldehit çapraz bağlanmasının, bazı ilaçların veya GTP6 gibi fizyolojik moleküllerin bağlanmasıyla olanlara benzer şekilde, mikrotübülün ultrayapısında ince değişikliklere neden olduğunu doğrulamaktadır.
Bu nedenle, lekesiz, sabitlenmemiş numunelerde mikrotübüllerin doğrudan görselleştirilmesi genellikle arzu edilir. Bunu başarmak için, bir teknik çözüm, paralel mikrotübül demetlerinin harmonofor gibi davranma ve yoğun, darbeli bir kızılötesi lazerle uygun şekilde aydınlatıldığında frekansı iki katına çıkaran ışık yayma yeteneğine dayanan ikinci harmonik nesil (SHG) mikroskopi7’dir. Frekans ikiye katlanabildiği bilinen diğer iki biyolojik materyal olan kollajen ve miyosin’den daha güçlü ve daha kararlı bir ikinci harmonik sinyal üretilebilse de, tübülinden gelen sinyal şimdiye kadar çoğunlukla mitotik iğ yeniden düzenlemelerini incelemek için kullanılmıştır 8,9,10 ve aksonal mikrotübül morfolojisi11,12,13.
Bu çalışmada, tübülin beta 4 A (TUBB4A) tübülinopatisinden etkilenen merkezi sinir sistemi (CNS) dokularını sağlıklı muadillerinden ayırt etmek için tanı aracı olarak SHG mikroskobunun yeni bir kullanımını tanıtıyoruz14. Tübülinin bu ağırlıklı olarak nöral izoformunda meydana gelen mutasyonlardan bazıları, bazal gangliyon ve serebellumun (H-ABC) hipomiyelinasyonuna ve atrofisine neden olanlar gibi, oligodendrositlerde mikrotübül aşırı dolgusunu indükler15,16; sitoiskelet değişiklikleri, sırayla, dismiyelinasyon gibi aşağı akış etkileriyle, motor ve duyusal yolakların derin bozulmasıyla ilişkilidir16,17,18,19. Bu çalışmada kullanılan taiep murin modeli, oligodendrositlerde anormal mikrotübül içeriği gösterir ve H-ABC hastalarının duyusal-motor semptomlarının çoğunu özetler17. Protokol, sağlıklı ve mutant dokular arasındaki SH sinyallerindeki farklılıkları vurgulamak için, genellikle yüksek oranda miyelinli olan ve insan hastalarında ve taiep sıçan19’da ciddi şekilde etkilenen korpus kallozum ve beyincik olarak yapıların nasıl görüntüleneceğini açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
SHG mikroskopisi, iki foton uyarma mikroskobu, üçüncü harmonik nesil mikroskopi ve tutarlı anti-Stokes Raman saçılma mikroskobu içeren ve geleneksel optik mikroskopinin yaşam bilimlerine uygulama yelpazesinin genişletilmesine katkıda bulunan bir grup doğrusal olmayan optik tekniğin bir parçasıdır20.
Spesifik olarak, SHG mikroskobunun ana gücü ve zayıflığı aynı durumla ilgilidir: sinyal üreteci merkez-simetrik olmayan21’dir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) tarafından aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: VP-CIO’ya infraestructura 226450, V.P.’ye infraestructura 255277 ve FORDECYT-PRONACES/194171/2020 V.H.’ye. CIO’daki Juvenal Hernández Guevara’nın video yapımındaki desteğini kabul ediyoruz.
Materials
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
References
- Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
- Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
- Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
- Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
- Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
- Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530 (2019).
- Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277 (2001).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Yu, C. -. H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
- Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758 (2017).
- Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
- Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418 (2009).
- Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292 (2018).
- Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417 (2022).
- Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
- Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
- Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555 (2020).
- Lopez-Juarez, A., et al. Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy. Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).
- Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039 (2021).
- Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363 (2020).
- Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001 (2017).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466 (2002).
- Stoller, P., Kim, B. -. M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205 (2002).
- Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
- Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).
