في أوفو الحقن داخل الأوعية الدموية في أجنة الدجاج
Summary
الهدف العام من هذه الورقة هو وصف كيفية إجراء الحقن داخل الخلايا في البويضة للمواد الخارجية في أجنة الدجاج. هذا النهج مفيد جدا لدراسة البيولوجيا التنموية لأجنة الدجاج.
Abstract
كنظام نموذجي كلاسيكي لبيولوجيا الأجنة ، تم استخدام جنين الدجاج للتحقيق في التطور الجنيني والتمايز. إن توصيل المواد الخارجية إلى أجنة الدجاج له ميزة كبيرة لدراسة وظيفة الجينات ، والتربية المعدلة وراثيا ، وإعداد الوهم أثناء التطور الجنيني. نوضح هنا طريقة الحقن داخل الأوعية الدموية في البويضة حيث يمكن نقل المواد الخارجية مثل ناقلات البلازميد أو الخلايا الجرثومية البدائية المعدلة (PGCs) إلى أجنة الدجاج المانحة في مراحل النمو المبكرة. تظهر النتائج أن الحقن داخل الأوعية الدموية من خلال الشريان الأورطي الظهري والرأس يسمح للمواد المحقونة بالانتشار في الجنين بأكمله من خلال الدورة الدموية. في البروتوكول المقدم ، تم تحديد فعالية إدخال البلازميد الخارجي وناقلات الفيروسات الخيطية ، واستعمار PGCs الخارجية المحقونة في الغدد التناسلية المتلقية ، من خلال مراقبة التألق في الأجنة. تصف هذه المقالة الإجراءات التفصيلية لهذه الطريقة ، وبالتالي توفر نهجا ممتازا لدراسة وظيفة الجينات ، وبيولوجيا الجنين والنمو ، وإنتاج الدجاج الوهمي للغدد التناسلية. في الختام ، ستسمح هذه المقالة للباحثين بإجراء الحقن داخل الأوعية الدموية في البويضة للمواد الخارجية في أجنة الدجاج بنجاح كبير وقابلية للتكرار.
Introduction
تم استخدام أجنة الدجاج على نطاق واسع لعدة قرون في التطبيقات التنموية والمناعية والمرضية وغيرها من التطبيقات البيولوجية1،2،3. لديهم العديد من المزايا المتأصلة على النماذج الحيوانية الأخرى في دراسة علم السموم وبيولوجيا الخلية4. يمكن الوصول بسهولة إلى أجنة الدجاج ويمكن التلاعب بها في المختبر ومراقبتها مباشرة في أي مرحلة من مراحل النمو ، مما يوفر نظاما مفيدا لنموذج أبحاث الأجنة.
بشكل عام ، فإن طرق توصيل جنين الدجاج الحالية مثل النقل الكهربائي والحقن تحت الجرثومي لها قيود مثل متطلبات المعدات المتخصصة وبرنامج مصمم ، وعدم الكفاءة بسبب وجود صفار البيض والزلال5،6،7. نعرض هنا طريقة معالجة بسيطة وفعالة لتوصيل المواد الخارجية إلى أجنة الدجاج. هذا يمكن أن يكون أداة قوية تستخدم في دراسة علم الأحياء التنموي. تنتشر المواد المحقونة إلى الجنين بأكمله عن طريق الدورة الدموية. خلال التطور المبكر لأجنة الدجاج ، يمكن أن تهاجر PGCs عبر الدم ، وتستعمر التلال التناسلية ، ثم تتطور إلى أمشاج ، والتي توفر مسارا ممكنا قيما لتوصيل المواد الخارجية8. الآن ، تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع في دراسة وظيفة الجينات ، والبيولوجيا الجنينية والتنموية ، وإنتاج الدجاج الوهمي والمعدل وراثيا9،10،11.
في البويضة الحقن داخل الأوعية الدموية في أجنة الدجاج هي طريقة راسخة وشائعة الاستخدام12،13،14. في هذه الورقة ، نعرض وصفا شاملا لهذا البروتوكول بما في ذلك مواد الحقن والمواقع والجرعة والنتائج التمثيلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تحسين طريقة الحقن داخل الأوعية الدموية في البويضة لأجنة الدجاج للمواد الخارجية (الناقلة أو الفيروسية أو PGCs) ليتم نقلها إلى الجنين. بناء على هذه الطريقة ، قمنا ببناء نماذج جنين الدجاج مع فرط التعبير الجيني المستقر أو التداخل (SpinZ ، JUN ، UBE2I ، إلخ.) 17,18,19<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31972547). نحن نقدر تحرير النصوص من قبل جينغ وانغ والتعليق الصوتي من قبل مالك دونليك في جامعة ولاية واشنطن ، الولايات المتحدة الأمريكية.
Materials
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
