באובו הזרקה תוך-וסקולרית בעוברי עוף
Summary
המטרה הכוללת של מאמר זה היא לתאר כיצד לבצע בהזרקה תוך תאית של אובו של חומרים אקסוגניים לעוברי עוף. גישה זו שימושית מאוד כדי לחקור את הביולוגיה ההתפתחותית של עוברי תרנגולות.
Abstract
כמערכת מודל קלאסית של ביולוגיה של העובר, עובר העוף שימש לחקר ההתפתחות וההתמיינות העוברית. להעברת חומרים אקסוגניים לעוברי עוף יש יתרון גדול לחקר תפקוד הגנים, הרבייה המהונדסת והכנת הכימרה במהלך ההתפתחות העוברית. כאן אנו מראים את השיטה של הזרקה תוך-וסקולרית של אובו לפיה ניתן להעביר חומרים אקסוגניים כגון וקטורים פלסמידיים או תאי נבט ראשוניים שעברו שינוי (PGCs) לעוברי עוף תורמים בשלבים התפתחותיים מוקדמים. התוצאות מראות כי ההזרקה התוך-וסקולרית דרך אבי העורקים הגבי והראש מאפשרת לחומרים מוזרקים להתפזר לתוך העובר כולו דרך מערכת הדם. בפרוטוקול המוצג, היעילות של פלסמיד אקסוגני והכנסת וקטורים לנטי-ויראליים, והתיישבות של PGCs אקסוגניים מוזרקים בגונד המקבל, נקבעו על ידי התבוננות בפלואורסצנציה בעוברים. מאמר זה מתאר נהלים מפורטים של שיטה זו, ובכך מספק גישה מצוינת לחקר תפקוד הגנים, ביולוגיה עוברית והתפתחותית, וייצור עוף גונד-כימרי. לסיכום, מאמר זה יאפשר לחוקרים לבצע בהזרקה תוך-וסקולרית של חומרים אקסוגניים לעוברי עוף בהצלחה רבה ובשכפול.
Introduction
עוברי עוף נמצאים בשימוש נרחב במשך מאות שנים ביישומים התפתחותיים, אימונולוגיים, פתולוגיים וביולוגיים אחרים 1,2,3. יש להם יתרונות מובנים רבים על פני מודלים אחרים של בעלי חיים בחקר הטוקסיקולוגיה וביולוגיה של התא4. עוברי עוף נגישים בקלות וניתן לתמרן אותם במבחנה ולצפות בהם ישירות בכל שלב התפתחותי, מה שמספק מערכת מודל שימושית לחקר העוברים.
באופן כללי, לשיטות הנוכחיות של העברת עוברי עוף כגון אלקטרו-טרנספקציה והזרקת תת-קרקעית לחלל יש מגבלות כגון הדרישה לציוד מומחה ותוכנית מתוכננת, וחוסר יעילות בשל נוכחות של חלמון ואלבומן 5,6,7. כאן אנו מראים שיטת טיפול פשוטה ויעילה להעברת חומרים אקסוגניים לעוברי עוף. זה יכול להיות כלי רב עוצמה המשמש בחקר הביולוגיה ההתפתחותית. החומרים המוזרקים התפשטו לכל העובר באמצעות זרימת הדם. במהלך ההתפתחות המוקדמת של עוברי עוף, המחשבים האישיים יכלו לנדוד דרך הדם, ליישב את רכס איברי המין, ולאחר מכן להתפתח לגמטות, המספקות נתיב אפשרי רב ערך להעברת חומרים אקסוגניים8. כעת, שיטה זו שימשה באופן נרחב בחקר תפקוד הגנים, ביולוגיה עוברית והתפתחותית, וייצור עופות כימריים ומהונדסים 9,10,11.
ב ovo הזרקה תוך וסקולרית בעוברי עוף היא שיטה מבוססת היטב בשימוש נפוץ 12,13,14. במאמר זה אנו מציגים תיאור מקיף של פרוטוקול זה, כולל חומרי הזרקה, אתרים, מינון ותוצאות מייצגות.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה של הזרקה תוך-וסקולרית של אובו של עוברי עוף מותאמת לחומרים אקסוגניים (וקטוריים, נגיפיים או מחשבים אישיים) שיועברו לעובר. בהתבסס על שיטה זו, בנינו מודלים של עוברי עוף עם ביטוי יתר או הפרעה יציבים של גנים (SpinZ, JUN, UBE2I וכו ‘). 17,18,19. מודל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31972547). אנו מעריכים את ההעתקה של ג’ינג וואנג ואת הקריינות של מאליק דונליק באוניברסיטת מדינת וושינגטון, ארה”ב.
Materials
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
