Ovo में चिकन भ्रूण में इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन
Summary
इस पेपर का समग्र लक्ष्य यह वर्णन करना है कि चिकन भ्रूण में बहिर्जात सामग्रियों के ओवो इंट्रासेल्युलर इंजेक्शन में कैसे प्रदर्शन किया जाए। यह दृष्टिकोण चिकन भ्रूण के विकासात्मक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी है।
Abstract
भ्रूण जीव विज्ञान की एक शास्त्रीय मॉडल प्रणाली के रूप में, चिकन भ्रूण का उपयोग भ्रूण के विकास और भेदभाव की जांच करने के लिए किया गया है। चिकन भ्रूण में बहिर्जात सामग्री वितरित करने से भ्रूण के विकास के दौरान जीन फ़ंक्शन, ट्रांसजेनिक प्रजनन और चिमेरा तैयारी का अध्ययन करने के लिए एक बड़ा लाभ है। यहां हम ओवो इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन की विधि दिखाते हैं जिससे प्लास्मिड वैक्टर या संशोधित आदिम रोगाणु कोशिकाओं (पीजीसी) जैसी बहिर्जात सामग्रियों को प्रारंभिक विकास चरणों में दाता चिकन भ्रूण में स्थानांतरित किया जा सकता है। परिणाम बताते हैं कि पृष्ठीय महाधमनी और सिर के माध्यम से इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन इंजेक्टेड सामग्रियों को रक्त संचार प्रणाली के माध्यम से पूरे भ्रूण में फैलाने की अनुमति देता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, बहिर्जात प्लास्मिड और लेंटिवायरल वेक्टर परिचय की प्रभावकारिता, और प्राप्तकर्ता गोनाड में इंजेक्ट किए गए बहिर्जात पीजीसी के उपनिवेशीकरण को भ्रूण में प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करके निर्धारित किया गया था। यह लेख इस विधि की विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन करता है, जिससे जीन फ़ंक्शन, भ्रूण और विकासात्मक जीव विज्ञान, और गोनाड-चिमेरिक चिकन उत्पादन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट दृष्टिकोण प्रदान किया जाता है। अंत में, यह लेख शोधकर्ताओं को बड़ी सफलता और पुनरुत्पादन के साथ चिकन भ्रूण में बहिर्जात सामग्री के ओवो इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन में प्रदर्शन करने की अनुमति देगा।
Introduction
चिकन भ्रूण व्यापक रूप से विकासात्मक, प्रतिरक्षाविज्ञानी, रोग, और अन्य जैविक अनुप्रयोगों 1,2,3 में सदियों से उपयोग किया जाता है। उनके पास विष विज्ञान और सेल जीव विज्ञान 4 के अध्ययन में अन्य पशु मॉडल पर कई अंतर्निहित फायदेहैं। चिकन भ्रूण आसानी से सुलभ हैं और विट्रो में हेरफेर किया जा सकता है और सीधे किसी भी विकास के चरण में मनाया जा सकता है, जो एक आसान भ्रूण अनुसंधान मॉडल प्रणाली प्रदान करता है।
सामान्य तौर पर, इलेक्ट्रोट्रांसफेक्शन और सबजर्मिनल-कैविटी इंजेक्शन जैसे वर्तमान चिकन भ्रूण वितरण विधियों में विशेषज्ञ उपकरण ों की आवश्यकता और एक डिज़ाइन किए गए कार्यक्रम की आवश्यकता और जर्दी और एल्बुमेन 5,6,7 की उपस्थिति के कारण अक्षमता जैसी सीमाएं हैं। यहां हम चिकन भ्रूण में बहिर्जात सामग्री देने के लिए एक सरल और कुशल हैंडलिंग विधि दिखाते हैं। यह विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है। इंजेक्टेड सामग्री रक्त परिसंचरण के माध्यम से पूरे भ्रूण में फैल जाती है। चिकन भ्रूण के शुरुआती विकास के दौरान, पीजीसी रक्त के माध्यम से माइग्रेट कर सकते हैं, जननांग रिज को उपनिवेशित कर सकते हैं, और फिर युग्मकों में विकसित हो सकते हैं, जो बहिर्जात सामग्री प्रदान करने के लिए एक मूल्यवान संभव मार्ग प्रदान करतेहैं। अब, इस विधि का व्यापक रूप से जीन फ़ंक्शन, भ्रूण और विकासात्मक जीव विज्ञान, और चिमेरिक और ट्रांसजेनिक चिकन उत्पादन 9,10,11 के अध्ययन में उपयोग किया गया है।
चिकन भ्रूण में ओवो इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन में एक अच्छी तरह से स्थापित और आमतौर पर उपयोग की जाने वाली विधि 12,13,14 है। इस पेपर में, हम इंजेक्शन सामग्री, साइटों, खुराक और प्रतिनिधि परिणामों सहित इस प्रोटोकॉल का एक व्यापक विवरण दिखाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
चिकन भ्रूण के ओवो इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन की विधि को बहिर्जात सामग्री (वेक्टर, वायरल, या पीजीसी) के लिए अनुकूलित किया जाता है जिसे भ्रूण में स्थानांतरित किया जाता है। इस विधि के आधार पर, हमने स्थिर ज…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31972547) द्वारा समर्थित किया गया था। हम जिंग वांग द्वारा कॉपी की गई बैठक और वाशिंगटन स्टेट यूनिवर्सिटी, यूएसए में मलिक डोनलिक द्वारा वॉइसओवर की सराहना करते हैं।
Materials
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
