Proteinfällung auf organischer Lösungsmittelbasis für eine robuste Proteomreinigung vor der Massenspektrometrie

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die lösungsmittelbasierte Proteinfällung unter kontrollierten Bedingungen für eine robuste und schnelle Gewinnung und Reinigung von Proteomproben vor der Massenspektrometrie.

Abstract

Während mehrere Fortschritte in der Massenspektrometrie (MS) die qualitative und quantitative Proteomanalyse verbessert haben, sind zuverlässigere Front-End-Ansätze zur Isolierung, Anreicherung und Verarbeitung von Proteinen vor MS entscheidend für eine erfolgreiche Proteomcharakterisierung. Geringe, inkonsistente Proteinrückgewinnung und Restverunreinigungen wie Tenside sind schädlich für die MS-Analyse. Die Proteinfällung wird im Vergleich zu anderen Probenvorbereitungsstrategien oft als unzuverlässig, zeitaufwendig und technisch anspruchsvoll angesehen. Diese Bedenken werden durch den Einsatz optimaler Proteinausscheidungsprotokolle überwunden. Für die Acetonfällung ist die Kombination von spezifischen Salzen, Temperaturregelung, Lösungsmittelzusammensetzung und Fällungszeit von entscheidender Bedeutung, während die Effizienz der Chloroform-/Methanol-/Wasserfällung von der richtigen Pipettierung und der Manipulation der Durchstechflasche abhängt. Alternativ werden diese Fällungsprotokolle in einer Einweg-Spinkartusche optimiert und halbautomatisch. Die erwarteten Ergebnisse der lösungsmittelbasierten Proteinfällung im konventionellen Format und unter Verwendung einer zweistufigen Einweg-Filtrations- und Extraktionskartusche werden in dieser Arbeit veranschaulicht. Dazu gehört die detaillierte Charakterisierung proteomischer Gemische durch Bottom-up-LC-MS/MS-Analyse. Die überlegene Leistung von SDS-basierten Arbeitsabläufen wird auch im Vergleich zu nicht kontaminiertem Protein demonstriert.

Introduction

Die Proteomanalyse durch Massenspektrometrie ist aufgrund der verbesserten Empfindlichkeit, Auflösung, Scangeschwindigkeit und Vielseitigkeit moderner MS-Instrumente immer strenger geworden. MS-Fortschritte tragen zu einer höheren Proteinidentifizierungseffizienz und einer präziseren Quantifizierung^bei 1,2,3,4,5. Mit verbesserter MS-Instrumentierung fordern die Forscher eine entsprechend konsistente Front-End-Probenvorbereitungsstrategie, die in der Lage ist, hochreine Proteine in kürzester Zeit über alle Phasen des Workflows hinweg quantitativ zurückzugewinnen 6,7,8,9,10,11 . Um den Proteomstatus eines biologischen Systems genau widerzuspiegeln, müssen Proteine effizient und unvoreingenommen aus der nativen Probenmatrix isoliert werden. Zu diesem Zweck gewährleistet die Einbeziehung eines denaturierenden Tensids wie Natriumdodecylsulfat (SDS) eine effiziente Proteinextraktion und -solubilisierung¹². SDS stört jedoch stark die Elektrospray-Ionisation, was zu einer starken MS-Signalunterdrückung führt, wenn es nicht ordnungsgemäß eliminiert^{wird 13}.

Für die anschließende Proteomanalyse stehen verschiedene SDS-Depletionsstrategien zur Verfügung, wie z.B. die Retention von Proteinen über einem Molekulargewichts-Cutoff-Filter, der in Einweg-Spinkartuschen^14,15,16 enthalten ist. Die filtergestützte Probenvorbereitungsmethode (FASP) wird bevorzugt, da sie SDS unter 10 ppm effektiv erschöpft und eine optimale MS ermöglicht. Die Proteinrückgewinnung mit FASP ist jedoch variabel, was die Erforschung anderer Techniken veranlasste. Chromatographische Ansätze, die selektiv Protein (oder Tensid) einfangen, haben sich zu verschiedenen praktischen Kartuschen oder perlenbasierten Formaten entwickelt 17,18,19,20,21. Angesichts dieser einfachen und (idealerweise) konsistenten Strategien zur Proteinreinigung wird der klassische Ansatz der Proteinfällung mit organischen Lösungsmitteln oft als vielversprechender Ansatz zur Proteinisolierung übersehen. Während gezeigt wird, dass die Ausfällung von Lösungsmitteln SDS erfolgreich unter kritische Werte abbaut, ist die Proteinrückgewinnung seit langem ein Problem dieses Ansatzes. Mehrere Gruppen haben eine Proteinrückgewinnungsverzerrung beobachtet, mit inakzeptabel niedrigen Niederschlagsausbeuten als Funktion der Proteinkonzentration, des Molekulargewichts und der Hydrophobie^22,23. Aufgrund der Vielfalt der in der Literatur berichteten Niederschlagsprotokolle wurden standardisierte Niederschlagsbedingungen entwickelt. Im Jahr 2013 berichteten Crowell et al. erstmals über die Abhängigkeit der Ionenstärke von der Ausfällungseffizienz von Proteinen in 80% Aceton²⁴. Für alle untersuchten Proteine erwies sich die Zugabe von bis zu 30 mM Natriumchlorid als unerlässlich, um die Ausbeute zu maximieren (bis zu 100% Rückgewinnung). In jüngerer Zeit zeigten Nickerson et al., dass die Kombination von noch höherer Ionenstärke (bis zu 100 mM) mit erhöhter Temperatur (20 °C) während der Acetonfällung zu einer nahezu quantitativen Erholung in 2-5 min²⁵ führte. Es wurde ein leichter Rückgang der Rückgewinnung von niedermolekularen (LMW) Proteinen beobachtet. Daher zeigte ein nachfolgender Bericht von Baghalabadi et al. die erfolgreiche Rückgewinnung von LMW-Proteinen und Peptiden (≤5 kDa) durch Kombination spezifischer Salze, insbesondere Zinksulfat, mit einem höheren Gehalt an organischem Lösungsmittel (97% Aceton)^26.

Während die Verfeinerung des Fällungsprotokolls eine zuverlässigere Proteinreinigungsstrategie für MS-basierte Proteomik verleiht, hängt der Erfolg der konventionellen Niederschlagung stark von der Benutzertechnik ab. Ein primäres Ziel dieser Arbeit ist es, eine robuste Fällungsstrategie zu präsentieren, die die Isolierung des Proteinpellets vom kontaminierenden Überstand erleichtert. Eine Einwegfiltrationskartusche wurde entwickelt, um das Pipettieren zu eliminieren, indem aggregiertes Protein über einem porösen PTFE-Membranfilter^{isoliert wird 27}. MS-störende Bauteile im Überstand werden in einem kurzen, langsamen Zentrifugationsschritt effektiv entfernt. Die Einweg-Filterpatrone bietet auch eine austauschbare SPE-Kartusche, die eine anschließende Probenreinigung nach der Resobilisierung und dem optionalen Proteinaufschluss vor der Massenspektrometrie ermöglicht.

Eine Reihe von empfohlenen Proteom-Fällungs-Workflows werden hier vorgestellt, einschließlich modifizierter Aceton- und Chloroform/Methanol/^{Wasser-28-Protokolle} , in einem konventionellen (auf Durchstechflaschen basierenden) und einem halbautomatischen Format in einer Einweg-Zwei-Zustands-Filtrations- und Extraktionskartusche. Die daraus resultierenden Proteinrückgewinnungsraten und SDS-Abbaueffizienzen werden zusammen mit der Bottom-up-LC-MS/MS-Proteomabdeckung hervorgehoben, um das erwartete Ergebnis jedes Protokolls zu demonstrieren. Die praktischen Vor- und Nachteile, die mit jedem Ansatz verbunden sind, werden diskutiert.

Protocol

1. Wesentliche Überlegungen und Probenvorbereitung Verwenden Sie nur hochreine Lösungsmittel (Aceton, Chloroform, Methanol) (>99,5%) und Chemikalien, frei von überschüssiger Feuchtigkeit. Natriumchlorid- und Zinksulfatlösungen (1 M) in Wasser herstellen.HINWEIS: Salzlösungen können unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden, solange sie frei von Verunreinigungen oder mikrobiellem Wachstum sind. Verwenden Sie die kleinste Mikrozentrifugendurchstechflasche aus Po…

Representative Results

Abbildung 4 fasst die erwartete SDS-Erschöpfung nach einer Fläschchen- oder kartuschengestützten Ausfällung von Proteinen in einer Einweg-Filterpatrone unter Verwendung von Aceton zusammen. Die konventionelle Inkubation über Nacht (-20 °C) in Aceton wird mit dem schnellen Acetonfällungsprotokoll bei Raumtemperatur (Schritt 2) sowie der CMW-Niederschlagsmenge (Schritt 4) verglichen. Das Rest-SDS wurde mit dem Methylenblau-Wirkstoff-Assay (MBAS)29 quantifiziert. …

Discussion

Eine optimale MS-Charakterisierung wird erreicht, wenn das verbleibende SDS unter 10 ppm erschöpft ist. Während alternative Ansätze wie FASP und Auf-Perlen-Verdauung eine quantitative SDS-Erschöpfung mit variabler Rückgewinnung^31,32,33 bieten, besteht das Hauptziel des Niederschlags darin^, Reinheit und Ertrag gleichzeitig zu maximieren. Dies hängt davon ab, den Überstand (der das SDS enthält) effektiv zu isolieren, ohne …

Materials

Acetone	Fisher Scientific	AC177170010	≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4	HPLC grade
Ammonium Bicarbonate	Millipore Sigma	A6141-1KG	solid
Beta mercaptoethanol	Millipore Sigma	M3148-25ML	Molecular biology grade
Bromophenol blue	Millipore Sigma	B8026-5G	Bromophenol blue sodium salt
Chloroform	Fisher Scientific	C298-400	Chloroform
Formic Acid	Honeywell	56302	Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer	ThermoFisher Scientific		for analysis of standard protein mixture
Glycerol	Millipore Sigma	356352-1L-M	For molecular biology, > 99%
Isopropanol	Fisher Scientific	A4641	HPLC grade
Methanol	Fisher Scientific	A452SK-4	HPLC grade
Microcentrifuge	Fisher Scientific	75-400-102	up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-130	tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-321	rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL)	Fisher Scientific	21-197-28	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL)	Fisher Scientific	07-200-302	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL)	Fisher Scientific	07-200-303	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes	Fisher Scientific	13-710-903	Micropipet Trio pack
Pepsin	Millipore Sigma	P0525000	Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG	Proteoform Scientific	PXG-0002	50 complete units per box
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S9888-1KG	ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate	ThermoFisher Scientific	28312	powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer	Bruker		for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid	ThermoFisher Scientific	L06374.AP	99%
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Molecular biology grade
Trypsin	Millipore Sigma	9002-07-7	From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea	Bio-Rad	1610731	solid
Water (deionized)	Sartorius Arium Mini Water Purification System	76307-662	Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate	Millipore Sigma	307491-100G	solid