Настоящий протокол описывает осаждение белка на основе растворителей в контролируемых условиях для надежного и быстрого восстановления и очистки образцов протеома перед масс-спектрометрией.
В то время как многочисленные достижения в инструментах масс-спектрометрии (РС) улучшили качественный и количественный анализ протеомов, более надежные интерфейсные подходы к выделению, обогащению и обработке белков перед РС имеют решающее значение для успешной характеристики протеома. Низкое, непоследовательное восстановление белка и остаточные примеси, такие как поверхностно-активные вещества, наносят ущерб анализу РС. Осаждение белка часто считается ненадежным, трудоемким и технически сложным для выполнения по сравнению с другими стратегиями подготовки образцов. Эти проблемы преодолеваются путем использования оптимальных протоколов осаждения белка. Для осаждения ацетона комбинация конкретных солей, контроля температуры, состава растворителя и времени осаждения имеет решающее значение, в то время как эффективность осаждения хлороформа / метанола / воды зависит от надлежащего пипетирования и манипуляции с флаконами. В качестве альтернативы, эти протоколы осаждения оптимизированы и полуавтоматизированы в одноразовом отжимном картридже. В данной работе проиллюстрированы ожидаемые результаты осаждения белка на основе растворителя в традиционном формате и с использованием одноразового двухступенчатого фильтрационного и экстракционного картриджа. Это включает в себя детальную характеристику протеомных смесей с помощью анализа LC-MS/MS снизу вверх. Превосходная производительность рабочих процессов на основе SDS также демонстрируется по сравнению с незагрязненным белком.
Анализ протеомов с помощью масс-спектрометрии становится все более строгим благодаря повышенной чувствительности, разрешению, скорости сканирования и универсальности современных приборов MS. Достижения РС способствуют повышению эффективности идентификации белка и более точному количественному определению 1,2,3,4,5. С улучшенными приборами MS исследователи требуют соответствующей последовательной стратегии подготовки образцов, способной количественно восстанавливать белки высокой чистоты за минимальное время на всех этапах рабочего процесса 6,7,8,9,10,11 . Чтобы точно отразить протеомный статус биологической системы, белки должны быть выделены из нативной матрицы образца эффективным и непредвзятым образом. С этой целью, включая денатурирующее поверхностно-активное вещество, такое как додецилсульфат натрия (SDS), обеспечивает эффективную экстракцию белка и солюбилизацию12. Тем не менее, SDS сильно препятствует электрораспылению ионизации, вызывая серьезное подавление сигнала MS, если не устранить должным образом13.
Для последующего анализа протеомов доступны различные стратегии истощения SDS, такие как удержание белков над фильтром отсечения молекулярной массы, содержащимся в одноразовых спиновых картриджах 14,15,16. Метод пробоподготовки с помощью фильтра (FASP) является предпочтительным, поскольку он эффективно истощает SDS ниже 10 ppm, способствуя оптимальному РС. Тем не менее, восстановление белка с помощью FASP является переменным, что побудило к исследованию других методов. Хроматографические подходы, которые избирательно захватывают белок (или поверхностно-активное вещество), превратились в различные удобные картриджи или форматы на основе бусин 17,18,19,20,21. Учитывая эти простые и (в идеале) последовательные стратегии очистки белка, классический подход осаждения белка органическими растворителями часто упускается из виду как перспективный подход к выделению белка. В то время как осаждение растворителей успешно истощает SDS ниже критических уровней, восстановление белка является давней проблемой этого подхода. Несколько групп наблюдали смещение восстановления белка, с неприемлемо низким выходом осадков в зависимости от концентрации белка, молекулярной массы и гидрофобности22,23. В связи с разнообразием протоколов осаждения, о которых сообщается в литературе, были разработаны стандартизированные условия осаждения. В 2013 году Crowell et al. впервые сообщили о зависимости ионной силы от эффективности осаждения белков в 80% ацетона24. Было показано, что для всех исследованных белков добавление до 30 мМ хлорида натрия необходимо для максимизации выхода (до 100% восстановления). Совсем недавно Nickerson et al. показали, что сочетание еще более высокой ионной силы (до 100 мМ) с повышенной температурой (20 °C) во время осаждения ацетона давало почти количественное восстановление за 2-5 мин25. Наблюдалось небольшое снижение восстановления низкомолекулярных (LMW) белков. Таким образом, последующий отчет Baghalabadi et al. продемонстрировал успешное восстановление белков и пептидов LMW (≤5 кДа) путем объединения специфических солей, особенно сульфата цинка, с более высоким уровнем органического растворителя (97% ацетона)26.
В то время как совершенствование протокола осаждения обеспечивает более надежную стратегию очистки белка для протеомики на основе MS, успех обычных осадков в значительной степени зависит от пользовательской техники. Основной целью этой работы является представление надежной стратегии осаждения, которая облегчает выделение белковой гранулы из загрязняющего супернатанта. Одноразовый фильтрационный картридж был разработан для устранения пипетирования путем выделения агрегированного белка над пористым мембранным фильтром27 из PTFE. МС-интерферирующие компоненты в супернатанте эффективно удаляются на короткой низкоскоростной стадии центрифугирования. Одноразовый фильтрующий картридж также предлагает сменный картридж SPE, который облегчает последующую очистку образца после рерастворимости и дополнительного переваривания белка перед масс-спектрометрией.
Здесь представлен ряд рекомендуемых рабочих процессов осаждения протеомов, включая модифицированные протоколы ацетона и хлороформа/метанола/воды28 , в обычном (на основе флаконов) и полуавтоматическом формате в одноразовом двухсударственном фильтрационном и экстракционном картридже. Результирующее восстановление белка и эффективность истощения SDS выделены вместе с покрытием протеома LC-MS/MS снизу вверх, чтобы продемонстрировать ожидаемый результат от каждого протокола. Обсуждаются практические преимущества и недостатки, связанные с каждым подходом.
Оптимальная характеристика МС достигается при истощении остаточного СДС ниже 10 ppm. В то время как альтернативные подходы, такие как FASP и переваривание на шариках, предлагают количественное истощение SDS с переменным извлечением 31,32,33, основной целью …
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады. Авторы благодарят Bioinformatics Solutions Inc. (Ватерлоо, Канада) и SPARC BioCentre (молекулярный анализ) в больнице для больных детей (Торонто, Канада) за их вклад в сбор данных о РС.
Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |