ショウジョウバエ光受容体の光色素レベルを測定するための電気生理学的方法

Summary

我々は、(i)光子吸収後の光色素分子内の電荷変位と光受容体におけるそれらの膨大な量を利用すること、および(ii)ロドプシンおよびメタロドプシン光顔料状態の吸収スペクトルの違いを利用すること、の電気生理学的に双安定光顔料を特徴付けるためのプロトコルを提示する。これらのプロトコルは、双安定な光色素系に影響を及ぼす変異をスクリーニングするのに有用である。

Abstract

ショウジョウバエGタンパク質結合光色素ロドプシン(登録商標)は、タンパク質(オプシン)と発色団で構成されています。ロドプシンの活性化プロセスは、発色団の光子吸収誘導異性化によって開始され、オプシンの立体構造変化を促進し、第2の暗安定な光色素状態(メタロドプシン、M)をもたらす。ランダム変異誘発を用いたこの双安定光色素の調査には、変異ハエをスクリーニングするための簡単で堅牢な方法が必要である。したがって、機能性光顔料レベルの低下を測定するためのいくつかの方法が設計されている。そのような方法の1つは、光子吸収後の光顔料内の電荷変位および感光体に発現する膨大な量の光顔料分子を利用する。初期受容体電位(または初期受容体電流)と名付けられたこの電気信号は、様々な電気生理学的方法(例えば、網膜電図および全細胞記録)によって測定され、機能的光色素レベルに直線的に比例する。この方法の利点は、高い信号対雑音比、光顔料レベルの直接線形測定、およびロドプシンまたはメタロドプシン活性化の下流の光形質導入機構の独立性である。長期脱分極後電位(PDA)と呼ばれる追加の電気生理学的方法は、ショウジョウバエ光色素の二重安定性およびハエRおよびM色素状態の吸収スペクトルの違いを利用する。PDAは強い青色光によって誘導され、飽和量のロドプシンをメタロドプシンに変換し、暗闇の中で長時間にわたって光応答終端が失敗するが、強いオレンジ色の光を用いたメタロドプシンからロドプシンへの変換によって終了させることができる。PDAは大量の光色素変換を必要とする堅牢なシグナルであるため、光色素の生合成における小さな欠陥であっても、容易に検出可能な異常なPDAにつながる。実際、欠陥のあるPDA変異体は、光導入に重要な新規シグナル伝達タンパク質の同定につながった。

Introduction

Gタンパク質共役型受容体(GPCR)である光活性化ロドプシン(R)は、7膜貫通タンパク質(オプシン)と発色団で構成されています。ショウジョウバエのメラノガスター(ショウジョウバエ)では、光子吸収は11-cis-3-OH-網膜発色団のオールトランス-3-OH-網膜¹への異性化を誘導し、ロドプシンのメタロドプシンへの立体構造変化を促進する(M、図1A)。脊椎動物のロドプシンとは異なり、無脊椎動物の発色団の優勢な画分はオプシンから解離せず、生理活性な暗安定色素状態Mをもたらす。次に、全トランス-3-OH-網膜発色団による追加の光子吸収は、発色団^2,3の異性化を誘導し、11-シス–^3-OH-網膜発色団を有するR色素状態を生成する。R状態は、暗く、安定で、生理学的に非活性な光色素である。脊椎動物の光色素と同様に、発色団⁴の極めて速い光子再生経路に加えて、発色団再生のための代替酵素的遅経路が無脊椎動物に存在し、その中で、いくつかの段階が視受容体細胞^5,6を取り囲む網膜細胞において行われる。

ショウジョウバエは、無脊椎動物の光受容体を研究するためのモデル生物として大きな利点を伴う。特に、調製物のアクセシビリティと分子遺伝学を適用する能力は、ショウジョウバエを強力なモデルシステム⁷にしました。したがって、一般的な光形質導入および光色素レベルを研究するためのいくつかのインビボおよびエキソビボ実験方法、特に、確立されている。最も単純なインビボ法は、ショウジョウバエの眼の光に対する比較的大きな細胞外記録電圧応答を利用する。したがって、光刺激は、脊椎動物の眼の光に対するERG応答よりも〜3桁大きい細胞外網膜電図(ERG)記録を用いて測定することができる眼全体における電気電圧応答を呼び起こす^8、9。ショウジョウバエのERG応答は頑健で容易に得られるため、変異による光応答の異常を特定するのに便利な方法である。光に対するERG応答は、主に光受容体、色素(グリア)細胞、および薄層の二次ニューロンから生じる(図1B参照)。ERGの主な構成要素は、(i)光受容体の細胞外電圧応答、(ii)薄層ニューロンから生じる光刺激の開始時および終了時の「オン」および「オフ」一過性(図2A、インセット、ON、OFF)、(iii)グリア細胞の遅い応答(図2A、差し込み図、矢印)、および(iv)短時間および一過性応答、 過渡¹⁰のONに先行する光顔料活性化中の電荷変位から生じる(図2C[挿入図]、D、E)。この短い応答は、2つの相(M1およびM2、図2C[差し込み図])で構成され、数百万の光色素分子を同時に活性化する非常に強い光刺激によってのみ誘導することができる。青色刺激下では観察されない(図2D、青色トレース)し、光色素レベルが高度に低下した変異体(図2E、赤色トレース)では観察されないが、PLC活性を消失させる変異体(図2E、オレンジ痕跡)では、その振幅が軽度に増強される。M1相は、光受容体におけるMの活性化から生じるハエの典型的なERPである。正の極性(細胞内)を有するM1期は、通常の方法で神経伝達物質を符号反転シナプスで放出し、薄層ニューロンを活性化し、シナプス的に増幅されたM2相を生成することによって光受容体の脱分極に応答する。したがって、M1およびM2相の両方がM活性化^10、11を反映する。

感光体の脱分極は、光受容体軸索と薄層^10,11の単極性ニューロンとの間の符号反転シナプスから生じる角膜正の「オン」一過性^{を生成する(}図1B)。ERGの緩慢な上昇および崩壊は、主に一過性受容器電位(TRP)およびTRP様(TRPL)チャネル¹³、¹⁴、¹⁵を介した視細胞¹²からのK⁺流出に起因する色素細胞の脱分極(図2A、差し込み図、矢印)から生じる。これらの遅い動力学成分は、光に対する感光体応答の細胞内または全細胞記録と比較すると、感光体応答の波形を大きくマスクし、歪める^9,10。さらに、非常に強い照明では、「オン」過渡に先行し、部分的に融合する追加の過渡応答が観察されることがあります(図2C [差し込み図],D,E)。この信号は、光顔料¹⁰の大規模な活性化から直接生じる。

中性濃度(ND)およびカラーフィルター、ならびに強力な照明フラッシュを使用するいくつかの光レジームプロトコルは、一般に、特に光形質導入カスケードを調査するために開発されている。これらのプロトコルはまた、光色素の特性を調査するためにも使用されている。

強度応答プロトコルは、光強度の増加に対する眼全体のERG電圧応答のピーク振幅を測定します(図2A、B)。このプロトコルは、光⁹に対する光受容体細胞の感度の変化を検出するのを助ける。

長期脱分極後電位(PDA)プロトコルは、ロドプシンとメタロドプシンの吸収スペクトルの違いを利用して、 ショウジョウバエにおいて、Rの生理活性で暗く安定な中間体M状態への大規模な光色素変換を可能にする²。ERG電圧応答では、飽和光の比較的短いパルスが与えられ、結果として生じる電圧応答が記録される。この条件下では、膨大な量のロドプシン分子の1パーセント(〜1 x 108)のほんの一部(〜1 x¹⁰⁸)の活性化が天井に到達するのに十分であるため、脱分極信号によって天井(反転電位)に達する。光形質導入成分が非常に豊富に存在することは、光形質導入成分の濃度の大幅な低下または微妙な誤動作を伴う変異体においても、この天井に達することを確実にする。この状況は、これらの変異体の単離を排除する。Pakらは、視覚的変異体を単離するための信頼性が高く、明らかにする試験を求めてPDAスクリーニング⁷ を導入した。 ショウジョウバエ では、PDA応答は、光顔料変換を可能にする赤色スクリーニング色素を遺伝的に除去し、ロドプシンによって優先的に吸収される青色光の適用(図3A)によってもたらされ、したがって、RのM光顔料状態への大きな正味変換をもたらす。光形質導入終端は、RからMへの大きな正味変換によってフォト顔料のレベルで破壊され、その結果、光がオフになってからずっと持続的な励起が得られる(図2C、 図4A [上])。PDA期間中、光受容体はその後のテスト光に対する感度が低く、部分的に脱感作(不活性化)される。PDAは、ロドプシン生合成の軽微な欠陥も検出し、長期間にわたって興奮を維持する視細胞の最大能力を試験する。高濃度のロドプシンの存在に厳密に依存するので、光形質導入成分の不十分な補充について容易にスコアリングする。驚くべきことに、PDAスクリーンは多くの新しく非常に重要な視覚変異体を生み出した(Pak et ^al.7でレビュー)。したがって、Pakら⁷ によって単離されたPDA変異体は、 ショウジョウバエ の視覚系を分析するのに依然として非常に有用である。

PDAは青色光を飽和させることによって ショウジョウバエ に誘導され、光オフセットのずっと後に連続的な偏光解除をもたらす(図4A [上])。PDA誘導青色光を飽和させた後、周辺光受容体(R1-6)は、その最大容量で暗闇の中で連続的に活性のままであり、飽和に達する。PDA中の追加の飽和青色光は、R1-6細胞において何秒間も追加の応答を生じないが、PDAに重畳されたR7-8細胞において応答を誘導する。重ね合わせられた応答は、これらの細胞で発現される光色素(R7-8)¹⁶の異なる吸収スペクトルによって説明される。PDAは、飽和オレンジ色の光でMをRに戻す光変換によって抑制することができる(図4A [上])。PDAが視細胞を最大活性能力(強烈な白色光では達成できない状況)にもたらす能力は、 ショウジョウバエの視覚変異体をスクリーニングするための主要なツールであった理由を説明している。これは、正常な光色素レベルの生合成に関与するタンパク質の軽微な欠陥の検出も可能にするからである^17、18。PDA欠損変異体の2つのグループが単離されている:不活性化も後電位(nina)変異体も、不活性化も後電位(ina) 変異体でもない。前者の表現型は、PDAの欠如および光色素レベルの大きな低下から生じる関連する不活性化である(図4A [中央])。後者の表現型は、正常なロドプシンレベルを有するがTRPチャネルと相互作用するタンパク質を欠いている変異体において、まだ未知のメカニズムのために、青色光後の不活性化を示すが暗い脱分極を示さない(図4A [下])。

PDAは、M活性19、^20、21に結合して終了するアレスチン(ARR2)に対する光顔料の量の違い^{から生じる(}図1A)。ショウジョウバエの感光体において、光色素の量はARR2¹⁹の量よりも約5倍大きい。したがって、ARR2レベルは、RからMへの大きな正味光変換によって生成されたすべてのM分子を不活性化するには不十分であり、過剰のMを暗所で常に活性なままにする¹⁷、¹⁹、^20、22、23。このメカニズムは、突然変異またはカロテノイド剥奪によるPDA応答の排除を説明し^24,25、光色素レベルの低下を引き起こすが、アレスチンレベルには影響しない。さらに、この説明はまた、ヌルARR2(arr2³)変異対立遺伝子21の表現型も説明しており、その中でPDAは、19、^20、21の〜¹⁰倍調光青色光強度で達成することができた(図4B、C)。PDAはフライ感光体のユニークな特徴ではなく、R状態とは異なる吸収スペクトルを有する暗く安定なMを有するすべての試験種に現れ、R状態からM状態への光顔料の十分な光変換を可能にする。PDA現象学が発見された徹底的に調査された種はフジツボ(Balanus)光受容体であり、R状態の吸収スペクトルはM状態²よりも長い波長にある(図3B)。したがって、フライ内の状況とは異なり、フジツボでは、橙赤色光がPDAを誘導し、青色光が^PDA2を抑制する。

早期受容体電位(ERP)プロトコルは、RまたはM活性化の間に生じる電荷変位を利用する。視覚色素は、脊椎動物および無脊椎動物膜³の両方のシグナル伝達区画の表面膜の不可欠な部分である。したがって、光顔料分子が1つの中間状態から次の中間状態に変化する活性化プロセスは、電荷変位^4,26を伴う。光顔料分子が膜容量⁴と平行に電気的に整列するにつれて、急速な同期立体構造変化は表面膜の速い偏光変化を生じ、これは、ハエでは、ラブドミアと呼ばれる〜30,000〜50,000マイクロビリのスタックからなるシグナル伝達区画で起こる。この分極は、次いで、細胞膜が等しく分極されるまで、細胞体の膜容量を介して受動的に放電する。ERPは電荷変位の細胞外記録である。細胞内に記録されたERPは、細胞膜^4、27、28の時定数によって組み込まれた細胞外ERPを顕在化させる。視覚的色素電荷変位によって活性化される電流は、全細胞電圧クランプ記録^29,30(図5A-D)でも測定することができ、(初期の受容体電流(ERC)記録において)信号の動力学に対する膜容量の影響を最小限に抑えるという大きな利点がある。

プロトコルセクションは、ショウジョウバエ眼⁹からのERG測定およびショウジョウバエ単離オンマチジア^31、32からの全細胞記録によるERC測定を行う方法を記載する。また、一般的な光形質導入、特に光色素を調査するために使用される特定のプロトコルについても説明します。

Protocol

1. 網膜電図を用いた強度応答関係、長時間脱分極後電位(PDA)、初期受容体電位(ERP)の測定 D.メラノガスター製剤に適した飼育条件 D.メラノガスターハエを、24°Cの温度に維持されたインキュベーター内で、12時間の暗/光サイクルで食物を含む標準的な黄色のトウモロコシを含むボトルに入れて上げる 実験の少なくとも24時間前にハエのボトルを暗…

Representative Results

図2は、ERG技術の堅牢性と使いやすさを例示しています。それは簡単な電気生理学的セットアップを必要とする細胞外電圧記録の簡単な技術によって事実上無傷のフライで記録されるので堅牢である。堅牢性は、突然変異が光応答を強く減少または歪める場合でも、比較的大きな振幅(ミリボルト範囲)の光応答の記録を得ることによって現れる。したがって、経験の浅い?…

Discussion

ショウジョウバエ光受容体製剤を使用する主な利点は、そのアクセシビリティ、光刺激の容易さと精度、そして最も重要なのは、分子遺伝学の力を適用する能力^です7。広範な遺伝学的研究により、ショウジョウバエは複雑な生物学的プロセスの遺伝的解剖のための非常に有用なモデルシステムとして確立^{されています7}。ショウジョウバエゲ?…

Materials

1 mL syringe with elongated tip			Figure 6M
1 rough tweezers		Dumont #5, Standard	0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter	Molecular Device	Digidata 1200	Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier	Almost perfect electronics		Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table	Newport	VW-3036-OPT-01	Figure 7H
Capillaries	Harvard Apparatus	Borosilicate glass capillaries	1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex	Molecular Device		Software
CO2 tank
Cold light source	Schott	KL1500 LCD	Figure 6C
Delicate wipers	Kimtech		Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder			Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage	Home made		Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color)	Schott	OG590, Edge filter	Figure 7S
Filter (Color)	Schott	BP450/40 nm	Figure 7S
Filter (Color)	Blazers	550 nm	Figure 7S
Filter (Color) for cold light source	Schott	RG630	Figure 6C
Filter (Heat)	Schott	KG3	Figure 7S
Filters (Neutral density filter)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figure 7S
Flash Lamp system	Honeywell		Figure 7U
Fly sleeper system with injector	Inject + matic		Figure 6A-B
Lamp power supply	PTI	LPS-220	Figure 7W
Light detector	Home made		Phototransistor (Figure 7O)
Light guide			3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source			High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax	Home made		Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies	Home made		Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage	Almost perfect electronics		Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulator (mechanical fine)	Leitz Microsystems	Leitz Mechanical Micromanipulator	Figure 7F
pCLAMP	Molecular Device		Software
Petri dish			60 mm
Pulse generator	AMPI	Master 8	Figure 7A
Redux cream for electrocardiography	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crème
Shutter driver	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Single Channel Uni-stable	Figure 7V
Shutter system	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figure 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament			0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope	Nikon	SMZ-2B	Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope	Wild	Wild M5	With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters	Millex		22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller	Sutter/ Narishige	Model P-97/PP-830	Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater	Home made		See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figure 7X