Электрофизиологические методы измерения уровня фотопигмента в фоторецепторах дрозофилы

Summary

Представлен протокол электрофизиологической характеристики бистабильных фотопигментов: (i) использование смещений заряда внутри молекул фотопигмента после поглощения фотонов и их огромного количества в фоторецепторах и (ii) использование различий спектров поглощения состояний фотопигмента родопсина и метарходопсина. Эти протоколы полезны для скрининга мутаций, влияющих на бистабильные фотопигментные системы.

Abstract

Drosophila G-белок-связанный фотопигмент родопсин (R) состоит из белка (опсина) и хромофора. Процесс активации родопсина инициируется фотонной абсорбционно-индуцирующей изомеризацией хромофора, способствуя конформационным изменениям опсина и приводя ко второму темно-стабильному состоянию фотопигмента (метарходопсин, М). Исследование этого бистабильного фотопигмента с использованием случайного мутагенеза требует простых и надежных методов скрининга мутантных мух. Поэтому было разработано несколько методов измерения снижения функциональных уровней фотопигмента. Один из таких методов использует смещения заряда внутри фотопигмента после поглощения фотонов и огромного количества молекул фотопигмента, экспрессируемых в фоторецепторах. Этот электрический сигнал, называемый ранним рецепторным потенциалом (или ранним рецепторным током), измеряется различными электрофизиологическими методами (например, электроретинограммой и записями целых клеток) и линейно пропорционален функциональным уровням фотопигмента. Преимуществами этого метода являются высокое отношение сигнал/шум, прямое линейное измерение уровней фотопигмента и независимость механизмов фототрансдукции после активации родопсина или метарходопсина. Дополнительный электрофизиологический метод, называемый пролонгированным деполяризующим послепотенциальным (PDA), использует бистабильность фотопигмента Drosophila и абсорбционно-спектральные различия пигментных состояний мух R и M. КПК индуцируется интенсивным синим светом, превращая насыщенное количество родопсина в метародопсин, что приводит к сбою прекращения светового отклика в течение длительного времени в темноте, но оно может быть прекращено превращением метарходопсина в родопсин с использованием интенсивного оранжевого света. Поскольку КПК является надежным сигналом, который требует массивного преобразования фотопигмента, даже небольшие дефекты в биогенезе фотопигмента приводят к легко обнаруживаемому аномальному КПК. Действительно, дефектные мутанты PDA привели к идентификации новых сигнальных белков, важных для фототрансдукции.

Introduction

Светоактивированный родопсин (R), который является рецептором, связанным с G-белком (GPCR), состоит из 7 трансмембранных белков (опсин) и хромофора. У Drosophila melanogaster (плодовая муха) поглощение фотонов индуцирует изомеризацию хромофора 11-цис-3-ОН-ретинальной хромофора в all-trans-3-OH-retinal¹, способствуя конформационному изменению родопсина на метародопсин (M, рисунок 1A). В отличие от позвоночного родопсина, преобладающая фракция хромофора беспозвоночных не диссоциирует от опсина, в результате чего возникает физиологически активное темно-стабильное пигментное состояние М. В свою очередь, дополнительное поглощение фотонов полностью транс-транс-3-ОН-хромофором сетчатки индуцирует изомеризацию хромофора ^2,3, генерируя R-пигментное состояние с 11-цис-3-ОН-ретинальным хромофором. R-состояние представляет собой темный, стабильный и физиологически неактивный фотопигмент. В дополнение к чрезвычайно быстрому пути регенерации фотонов хромофора⁴, очень похожему на фотопигменты позвоночных, у беспозвоночных существует альтернативный ферментативный медленный путь регенерации хромофора, в котором некоторые из стадий выполняются в клетках сетчатки, окружающих клетки фоторецепторов ^5,6.

Дрозофила влечет за собой большие преимущества в качестве модельного организма для изучения фоторецепторов беспозвоночных. В частности, доступность препарата и возможность применения молекулярной генетики сделали дрозофилу мощной модельной системой⁷. Таким образом, было установлено несколько экспериментальных методов in vivo и ex vivo для изучения фототрансдукции в целом и уровней фотопигмента в частности. Простейший метод in-vivo использует относительно большую внеклеточную зарегистрированную реакцию напряжения на свет глаза дрозофилы. Соответственно, световая стимуляция вызывает реакцию электрического напряжения во всем глазу, которая может быть измерена с помощью записи внеклеточной электроретинограммы (ERG), которая ~ 3 порядка больше, чем реакция ERG на свет глаз позвоночных ^8,9. Ответ Drosophila ERG является надежным и легко получаемым, что делает его удобным методом выявления аномалий светового ответа из-за мутаций. Реакция ERG на свет возникает в основном из фоторецепторов, пигментных (глийных) клеток и вторичных нейронов пластинки (см. Рисунок 1B). Основными компонентами ERG являются (i) внеклеточный ответ напряжения фоторецепторов, (ii) переходные процессы «вкл» и «выкл» в начале и конце светового стимула, которые возникают из нейронов ламины (рисунок 2A, вставка, ON, OFF), (iii) медленный ответ клеток глии (рисунок 2A, вставка, стрелки) и (iv) краткий и переходный ответ, в результате смещения заряда при активации фотопигмента, которая предшествует переходному переходу^{ON 10} (рисунок 2C [вставка], D, E). Этот краткий ответ состоит из двух фаз (M1 и M2, рисунок 2C [вставка]) и может быть вызван только чрезвычайно сильной световой стимуляцией, которая одновременно активирует миллионы молекул фотопигмента. Он не наблюдается ни при синей стимуляции (рисунок 2D, синий след), ни у мутантов с сильно сниженными уровнями фотопигмента (рисунок 2E, красный след), но его амплитуда слегка усиливается у мутанта, который отменяет активность ПЛК (рисунок 2E, оранжевый след). Фаза M1 является типичной ERP мухи, возникающей в результате активации M в фоторецепторах. Фаза M1, которая имеет положительную полярность (внутриклеточную), высвобождает нейротрансмиттер нормальным образом в синапсе, инвертирующем знак, и активирует нейроны lamina, которые реагируют на деполяризацию фоторецепторов, генерируя синаптически усиленную фазу M2. Таким образом, фазы М1 и М2 отражают активацию М^10,11.

Деполяризация фоторецептора генерирует роговично-положительный переходный процесс «на», возникающий из знаково-инвертирующего синапса между аксоном фоторецептора и монополярными нейронами пластинки^10,11 (рисунок 1В). Медленный подъем и распад ЭРГ возникают в результате деполяризации пигментных клеток (рисунок 2А, вставка, стрелки) в основном из-за выброса K⁺ из фоторецепторных клеток¹² через транзиторный рецепторный потенциал (TRP) и TRP-подобные (TRPL) каналы^13,14,15. Эти медленные кинетические компоненты в значительной степени маскируют и искажают форму сигнала реакции фоторецептора по сравнению с внутриклеточными или цельноклеточными записями реакции фоторецептора на свет ^9,10. Кроме того, при очень сильном освещении может наблюдаться дополнительная переходная реакция, которая предшествует и частично сливается с переходным процессом «on» (рисунок 2C [вставка], D, E). Этот сигнал исходит непосредственно от массивной активации фотопигмента¹⁰.

Несколько протоколов светового режима с использованием нейтральной плотности (ND) и цветных фильтров, а также сильных осветительных вспышек были разработаны для исследования глаза в целом и каскада фототрансдукции в частности. Эти протоколы также использовались для исследования свойств фотопигмента.

Протокол интенсивности-отклика измеряет пиковую амплитуду реакции напряжения ERG всего глаза на увеличение интенсивности света (рисунок 2A, B). Этот протокол помогает обнаружить изменения чувствительности фоторецепторных клеток к свету⁹.

Протокол пролонгированной деполяризации послепотенциала (PDA) использует различия в спектрах поглощения родопсина и метародопсина, что позволяет в дрозофиле массивное фотопигментное преобразование R в его физиологически активное и темно-стабильное промежуточное M-состояние². В ответе напряжения ERG подается относительно короткий импульс насыщенного света, и результирующая реакция напряжения регистрируется. При этом потолок (обратный потенциал) достигается сигналом деполяризации, поскольку активации доли процента от огромного количества молекул родопсина (~1 х 10⁸) достаточно для достижения потолка. Наличие компонентов фототрансдукции в большом изобилии гарантирует, что этот потолок будет достигнут даже у мутантов со значительным снижением концентрации или тонким сбоем компонентов фототрансдукции. Такая ситуация исключает изоляцию этих мутантов. Pak et al. представили скрининг PDA⁷ в поисках надежного и показательного теста для изоляции визуальных мутантов. У дрозофилы реакция КПК вызвана генетическим удалением красного экранирующего пигмента, что позволяет превращать фотопигмент, и применением синего света, который преимущественно поглощается родопсином (рисунок 3A) и, таким образом, приводит к большому чистому преобразованию R в состояние фотопигмента M. Окончание фототрансдукции нарушается на уровне фотопигмента большим чистым преобразованием R в M, что, в свою очередь, приводит к устойчивому возбуждению в течение длительного времени после выключения света (рисунок 2C, рисунок 4A [вверху]). В течение периода ОАП фоторецепторы менее чувствительны к последующим тестовым огням и частично десенсибилизированы (инактивированы). PDA обнаруживает даже незначительные дефекты в биогенезе родопсина и проверяет максимальную способность фоторецепторной клетки поддерживать возбуждение в течение длительного периода. Поскольку он строго зависит от наличия высоких концентраций родопсина, он легко оценивается за недостаточное восполнение компонентов фототрансдукции. Примечательно, что экран КПК дал много новых и очень важных визуальных мутантов (рассмотренных в Pak et ^al.7). Таким образом, мутанты PDA, выделенные Pak et ^al.7 , по-прежнему чрезвычайно полезны для анализа зрительной системы Drosophila .

КПК индуцируется у дрозофилы путем насыщения синим светом, что приводит к непрерывной деполяризации в течение длительного времени после смещения света (рисунок 4A [вверху]). После насыщения КПК-индуцирующим синим светом периферические фоторецепторы (R1-6) остаются непрерывно активными в темноте на своей максимальной мощности, достигая насыщения. Дополнительные насыщенные синие огни во время КПК не вызывают никакого дополнительного ответа в клетках R1-6 в течение многих секунд, но вызывают ответ в клетках R7-8, который накладывается на КПК. Наложенные ответы объясняются различными спектрами поглощения фотопигментов, экспрессируемых в этих клетках (R7-8)¹⁶. КПК может быть подавлен фотоконверсией M обратно в R с насыщенным оранжевым светом (рисунок 4A [вверху]). Способность КПК доводить фоторецепторные клетки до их максимальной активной емкости, ситуация, которая не может быть достигнута интенсивным белым светом, объясняет, почему он был основным инструментом для скрининга визуальных мутантов дрозофилы. Это связано с тем, что он позволяет обнаруживать даже незначительные дефекты в белках, участвующих в биогенезе нормальных уровней фотопигмента^17,18. Были выделены две группы дефектных мутантов PDA: ни инактивационные, ни послепотенциальные (нина) мутанты и инактивация, но не постпотенциальные (ina) мутанты. Фенотип первого представляет собой отсутствие ОАП и связанную с ним инактивацию, возникающую в результате значительного снижения уровней фотопигмента (рисунок 4А [средний]). Фенотип последнего показывает инактивацию, но не темную деполяризацию после синего света из-за все еще неизвестного механизма у мутанта с нормальным уровнем родопсина, но без белков, взаимодействующих с каналами TRP (рисунок 4A [внизу]).

КПК возникает из-за разницы в количестве фотопигмента относительно арестина (ARR2), который связывает и прекращает^{активность M} 19,20,21 (рисунок 1A). В фоторецепторах дрозофилы количество фотопигмента примерно в пять раз больше, чем количество ARR2¹⁹. Таким образом, уровни ARR2 недостаточны для инактивации всех молекул M, генерируемых большой чистой фотоконверсией R в M, оставляя избыток M постоянно активным в темноте 17,19,20,22,23. Этот механизм объясняет устранение ответа ОАП мутациями или каротиноидной депривацией^24,25, вызывая снижение уровня фотопигмента, но не влияет на уровни арестина. Кроме того, это объяснение также учитывает фенотипы нулевого мутантного аллеля²¹ ARR2 (arr2³), в котором КПК может быть достигнут при ~10-кратной диммере интенсивности синего света^19,20,21 (рисунок 4B,C). КПК не является уникальной особенностью фоторецепторов мух, и она появляется у каждого тестируемого вида, который имеет темный стабильный M со спектром поглощения, отличным от спектра R-состояния, что позволяет достаточную фотоконверсию фотопигмента из состояния R в состояние M. Тщательно исследованным видом, у которого была обнаружена феноменология PDA, является фоторецептор ракушки (Balanus), у которого спектр поглощения R-состояния находится в большей длине волны, чем состояние M² (рисунок 3B). Соответственно, в отличие от ситуации в мухе, в ракушке оранжево-красный свет индуцирует КПК, в то время как синий свет подавляет КПК².

Протокол раннего рецепторного потенциала (ERP) использует смещение заряда, происходящее во время активации R или M. Зрительный пигмент является неотъемлемой частью поверхностной мембраны сигнального отсека как позвоночных, так и беспозвоночных мембран³. Соответственно, процесс активации, при котором молекулы фотопигмента изменяются из одного промежуточного состояния в другое, сопровождается смещением заряда ^4,26. Поскольку молекулы фотопигмента электрически выровнены параллельно емкости мембраны⁴, быстрое синхронизированное конформационное изменение порождает быстрое поляризационное изменение поверхностной мембраны, которое у мух происходит в сигнальном отсеке, состоящем из стека из ~ 30 000-50 000 микроворсинок, называемых рабдомером. Эта поляризация затем пассивно разряжается через мембранную емкость клеточного тела до тех пор, пока клеточная мембрана не будет одинаково поляризована. ERP – это внеклеточная запись смещения заряда. Внутриклеточный зарегистрированный ERP проявляет внеклеточную ERP, интегрированную константой времени клеточной мембраны ^4,27,28. Ток, активируемый визуальным смещением заряда пигмента, также может быть измерен в записях^29,30 напряжения цельных ячеек (рисунок 5A-D), с основным преимуществом (в записях раннего рецепторного тока (ERC)) минимизации влияния емкости мембраны на кинетику сигнала.

В разделе протокола описывается, как выполнять измерения ERG из Drosophila eye⁹ и измерения ERC с помощью полноклеточных записей из изолированной ромматидии Drosophila ^31,32. Мы также описываем конкретные протоколы, которые используются для исследования фототрансдукции в целом и фотопигментов в частности.

Protocol

1. Измерение зависимости интенсивности реакции, длительной деполяризующей афпотенциальной (PDA) и раннего рецепторного потенциала (ERP) с помощью электроретинограммы Подходящие условия выращивания для приготовления меланогастера D. Выращивайте D. melanogaster мух в…

Representative Results

Рисунок 2 иллюстрирует надежность и простоту использования метода ERG. Он надежен, потому что он записывается в практически неповрежденной мухе с помощью простой техники внеклеточной записи напряжения, которая требует простой электрофизиологической установки. Надежно?…

Discussion

Основным преимуществом использования препарата фоторецептор Drosophila является его доступность, легкость и точность световой стимуляции, и, самое главное, способность применять силу молекулярной генетики⁷. Обширные генетические исследования установили дрозофилу ?…

Materials

1 mL syringe with elongated tip			Figure 6M
1 rough tweezers		Dumont #5, Standard	0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter	Molecular Device	Digidata 1200	Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier	Almost perfect electronics		Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table	Newport	VW-3036-OPT-01	Figure 7H
Capillaries	Harvard Apparatus	Borosilicate glass capillaries	1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex	Molecular Device		Software
CO2 tank
Cold light source	Schott	KL1500 LCD	Figure 6C
Delicate wipers	Kimtech		Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder			Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage	Home made		Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color)	Schott	OG590, Edge filter	Figure 7S
Filter (Color)	Schott	BP450/40 nm	Figure 7S
Filter (Color)	Blazers	550 nm	Figure 7S
Filter (Color) for cold light source	Schott	RG630	Figure 6C
Filter (Heat)	Schott	KG3	Figure 7S
Filters (Neutral density filter)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figure 7S
Flash Lamp system	Honeywell		Figure 7U
Fly sleeper system with injector	Inject + matic		Figure 6A-B
Lamp power supply	PTI	LPS-220	Figure 7W
Light detector	Home made		Phototransistor (Figure 7O)
Light guide			3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source			High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax	Home made		Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies	Home made		Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage	Almost perfect electronics		Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulator (mechanical fine)	Leitz Microsystems	Leitz Mechanical Micromanipulator	Figure 7F
pCLAMP	Molecular Device		Software
Petri dish			60 mm
Pulse generator	AMPI	Master 8	Figure 7A
Redux cream for electrocardiography	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crème
Shutter driver	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Single Channel Uni-stable	Figure 7V
Shutter system	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figure 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament			0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope	Nikon	SMZ-2B	Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope	Wild	Wild M5	With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters	Millex		22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller	Sutter/ Narishige	Model P-97/PP-830	Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater	Home made		See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figure 7X