Elektrofysiologiske metoder for måling av fotopigmentnivåer i Drosophila fotoreceptorer

Summary

Vi presenterer en protokoll for elektrofysiologisk karakterisering av bistabile fotopigmenter: (i) utnyttelse av ladningsforskyvningene i fotopigmentmolekylene etter fotonabsorpsjon og deres enorme mengde i fotoreseptorene, og (ii) utnyttelse av absorpsjonsspektraforskjellene i rhodopsin og metarhodopsin fotopigmenttilstander. Disse protokollene er nyttige for å skjerme for mutasjoner som påvirker bistabile fotopigmentsystemer.

Abstract

Drosophila G-proteinkoblet fotopigment rhodopsin (R) består av et protein (opsin) og en kromofor. Aktiveringsprosessen av rhodopsin initieres ved fotonabsorpsjonsinduserende isomerisering av kromoforen, fremmer konformasjonsendringer av opsinet og resulterer i en andre mørkstabil fotopigmenttilstand (metarhodopsin, M). Undersøkelse av dette bistabile fotopigmentet ved hjelp av tilfeldig mutagenese krever enkle og robuste metoder for screening av mutantfluer. Derfor er det utviklet flere metoder for å måle reduksjoner i funksjonelle fotopigmentnivåer. En slik metode utnytter ladningsforskyvningene i fotopigmentet etter fotonabsorpsjon og de enorme mengdene fotopigmentmolekyler uttrykt i fotoreceptorene. Dette elektriske signalet, kalt det tidlige reseptorpotensialet (eller tidlig reseptorstrøm), måles ved hjelp av en rekke elektrofysiologiske metoder (f.eks. Elektroretinogram og helcelleopptak) og er lineært proporsjonal med funksjonelle fotopigmentnivåer. Fordelene ved denne metoden er det høye signal-til-støy-forholdet, direkte lineær måling av fotopigmentnivåer og uavhengighet av fototransduksjonsmekanismer nedstrøms til rhodopsin- eller metarhodopsinaktivering. En ekstra elektrofysiologisk metode kalt langvarig depolariserende etterpotensiell (PDA) utnytter bistabiliteten til Drosophila fotopigment og absorpsjonsspektrale forskjeller i fly R og M pigmenttilstander. PDA er indusert av intenst blått lys, som konverterer mettende mengder rhodopsin til metarhodopsin, noe som resulterer i svikt i lysresponsterminering i lengre tid i mørket, men det kan avsluttes ved metarhodopsin til rhodopsinkonvertering ved bruk av intens oransje lys. Siden PDA er et robust signal som krever massiv fotopigmentkonvertering, fører selv små defekter i biogenesen til fotopigmentet til lett oppdaget unormal PDA. Faktisk førte defekte PDA-mutanter til identifisering av nye signalproteiner som er viktige for fototransduksjon.

Introduction

Det lysaktiverte rhodopsinet (R), som er en G-proteinkoblet reseptor (GPCR), består av et 7 transmembranprotein (opsin) og en kromofor. I Drosophila melanogaster (fruktflue) induserer fotonabsorpsjon isomerisering av 11-cis-3-OH-retinal kromofor til all-trans-3-OH-retinal¹, og fremmer konformasjonsendringen av rhodopsin til metarhodopsin (M, figur 1A). I motsetning til vertebrat rhodopsin, dissocierer den dominerende fraksjonen av invertebrat kromofor ikke fra opsin, noe som resulterer i den fysiologisk aktive mørkestabile pigmenttilstanden M. I sin tur induserer ytterligere fotonabsorering av all-trans-3-OH-retinal kromofor isomerisering av kromoforen ^2,3, og genererer R-pigmenttilstanden med 11-cis-3-OH-retinal kromofor. R-tilstanden er et mørkt, stabilt og fysiologisk ikke-aktivt fotopigment. I tillegg til den ekstremt raske fotonregenereringsruten til kromoforen⁴, i likhet med virveldyrfotopigmenter, finnes en alternativ enzymatisk langsom rute for kromoforregenerering hos hvirvelløse dyr, hvor noen av stadiene utføres i retinale celler som omgir fotoreceptorene celler ^5,6.

Drosophila medfører store fordeler som modellorganisme for å studere virvelløse fotoreceptorer. Spesielt har tilgjengeligheten av preparatet og evnen til å anvende molekylær genetikk gjort Drosophila til et kraftig modellsystem⁷. Derfor er det etablert flere in vivo og ex vivo eksperimentelle metoder for å studere fototransduksjon generelt og fotopigmentnivåer spesielt. Den enkleste in vivo-metoden utnytter den relativt store ekstracellulært registrerte spenningsresponsen på lys fra Drosophila-øyet. Følgelig fremkaller lysstimulering en elektrisk spenningsrespons i hele øyet som kan måles ved hjelp av ekstracellulær elektroretinogram (ERG) opptak, som er ~ 3 størrelsesordener større enn ERG-responsen på lys av vertebrate øyne ^8,9. Drosophila ERG-responsen er robust og lett oppnådd, noe som gjør den til en praktisk metode for å identifisere abnormiteter i lysrespons på grunn av mutasjoner. ERG-responsen på lys oppstår hovedsakelig fra fotoreseptorene, pigmentceller (glia) og sekundære nevroner i lamina (se figur 1B). Hovedkomponentene i ERG er (i) den ekstracellulære spenningsresponsen til fotoreseptorene, (ii) “på” og “av” transientene i begynnelsen og slutten av lysstimuleringen som oppstår fra lamina-nevronene (figur 2A, innfelt, ON, OFF), (iii) den langsomme responsen til gliacellene (figur 2A, innfelt, piler) og (iv) den korte og forbigående responsen, som følge av ladningsforskyvning under fotopigmentaktivering som går foran ON-transient¹⁰ (figur 2C [innfelt], D, E). Denne korte responsen består av to faser (M1 og M2, figur 2C [innfelt]) og kan bare induseres ved ekstremt sterk lysstimulering, som samtidig aktiverer millioner av fotopigmentmolekyler. Det er verken observert under blå stimulering (figur 2D, blått spor) eller hos mutanter med sterkt reduserte fotopigmentnivåer (figur 2E, rødt spor), men amplituden er mildt forbedret i en mutant som avskaffer PLC-aktivitet (figur 2E, oransje spor). M1-fasen er en typisk ERP av fluen som oppstår ved aktivering av M i fotoreceptorene. M1-fasen, som har en positiv polaritet (intracellulært), frigjør en nevrotransmitter på vanlig måte i en tegn-inverterende synapse og aktiverer lamina-nevronene, som reagerer på fotoreseptordepolariseringen ved å generere den synaptisk forsterkede M2-fasen. Dermed reflekterer både M1- og M2-faser M-aktivering^10,11.

Depolariseringen av fotoreseptoren genererer hornhinnen-positiv “på” transient, som oppstår fra den tegninverterende synapsen mellom fotoreseptoraksonet og monopolære nevroner i lamina^10,11 (figur 1B). Den langsomme stigningen og nedbrytningen av ERG oppstår fra depolariseringen av pigmentcellene (figur 2A, innfelt, piler) hovedsakelig på grunn av K ⁺ utstrømning fra fotoreseptorcellene¹² via det transiente reseptorpotensialet (TRP) og TRP-lignende (TRPL) kanaler 13,14,15. Disse langsomme kinetiske komponentene maskerer og forvrenger i stor grad bølgeformen til fotoreseptorresponsen sammenlignet med intracellulære eller helcelleopptak av fotoreseptorresponsen på lys ^9,10. I tillegg, ved svært sterke belysninger, kan en ekstra forbigående respons, som går foran og delvis smelter sammen med “på” transienten, observeres (figur 2C [innfelt], D, E). Dette signalet stammer direkte fra den massive aktiveringen av fotopigmentet¹⁰.

Flere lysregimeprotokoller ved bruk av nøytral tetthet (ND) og fargefiltre, samt sterke lysende blink, er utviklet for å undersøke øyet generelt og fototransduksjonskaskaden spesielt. Disse protokollene har også blitt brukt til å undersøke egenskapene til fotopigmentet.

Intensitetsresponsprotokollen måler toppamplituden til ERG-spenningsresponsen til hele øyet til økende lysintensiteter (figur 2A, B). Denne protokollen hjelper til med å oppdage endringer i følsomheten til fotoreseptorcellene til lys⁹.

Den langvarige depolariserende afterpotensielle (PDA) protokollen utnytter forskjellene i absorpsjonsspektrene til rhodopsin og metarhodopsin som i Drosophila tillater en massiv fotopigmentkonvertering av R til sin fysiologisk aktive og mørkestabile mellomliggende M-tilstand². I ERG-spenningsresponsen er det gitt en relativt kort puls av mettet lys, og den resulterende spenningsresponsen registreres. Under denne tilstanden nås et tak (reverseringspotensial) av depolariseringssignalet fordi aktivering av en brøkdel av en prosent av den enorme mengden rhodopsinmolekyler (~ 1 x 10⁸) er tilstrekkelig til å nå taket. Tilstedeværelsen av fototransduksjonskomponentene i stor overflod sikrer at dette taket nås selv i mutanter med en betydelig reduksjon i konsentrasjonen eller subtil funksjonsfeil i fototransduksjonskomponentene. Denne situasjonen utelukker isoleringen av disse mutantene. Pak og medarbeidere introduserte PDA-screening⁷ som søker en pålitelig og avslørende test for å isolere visuelle mutanter. I Drosophila er PDA-responsen forårsaket av genetisk fjerning av det røde screeningpigmentet, som tillater fotopigmentkonvertering, og anvendelse av blått lys, som fortrinnsvis absorberes av rhodopsin (figur 3A) og dermed resulterer i en stor nettokonvertering av R til M-fotopigmenttilstanden. Fototransduksjonsterminering forstyrres på fotopigmentnivå ved en stor nettokonvertering av R til M, noe som igjen resulterer i vedvarende eksitasjon lenge etter at lyset er slått av (figur 2C, figur 4A [topp]). I løpet av PDA-perioden er fotoreceptorene mindre følsomme for etterfølgende testlys og er delvis desensibiliserte (inaktiverte). PDA oppdager selv små defekter i rhodopsinbiogenese og tester fotoreseptorcellens maksimale kapasitet for å opprettholde eksitasjon i en lengre periode. Siden det strengt avhenger av tilstedeværelsen av høye konsentrasjoner av rhodopsin, scorer det lett for mangelfull påfylling av fototransduksjonskomponentene. Bemerkelsesverdig nok har PDA-skjermen gitt mange nye og svært viktige visuelle mutanter (gjennomgått i Pak et ^al.7). Dermed er PDA-mutantene isolert av Pak et ^al.7 fortsatt ekstremt nyttige for å analysere Drosophila visuelle system.

PDA induseres i Drosophila ved å mette blått lys, noe som resulterer i kontinuerlig depolarisering lenge etter lysforskyvning (figur 4A [topp]). Etter metning av PDA-induserende blått lys forblir de perifere fotoreseptorene (R1-6) kontinuerlig aktive i mørket ved maksimal kapasitet og når metning. Ytterligere mettende blålys under PDA gir ingen ekstra respons i R1-6-celler i mange sekunder, men induserer et svar i R7-8-celler som legges over PDA. De overliggende responsene forklares av de forskjellige absorpsjonsspektrene til fotopigmentene uttrykt i disse cellene (R7-8)¹⁶. PDA kan undertrykkes ved fotokonvertering av M tilbake til R med mettet oransje lys (figur 4A [øverst]). PDAs evne til å bringe fotoreseptorcellene til sin maksimale aktive kapasitet, en situasjon som ikke kan oppnås ved intenst hvitt lys, forklarer hvorfor det har vært et viktig verktøy for å skjerme for visuelle mutanter av Drosophila. Dette skyldes at det tillater påvisning av selv mindre defekter i proteiner involvert i biogenesen av normale fotopigmentnivåer ^17,18. To grupper av PDA defekte mutanter har blitt isolert: verken inaktivering eller etterpotensielle (nina) mutanter og inaktivering, men ikke etterpotensielle (ina) mutanter. Fenotypen til førstnevnte er mangel på en PDA og den tilhørende inaktiveringen som følge av en stor reduksjon i fotopigmentnivåene (figur 4A [midten]). Fenotypen til sistnevnte viser inaktivering, men ingen mørk depolarisering etter blått lys på grunn av en fortsatt ukjent mekanisme i mutanten med normale rhodopsinnivåer, men mangler proteiner som interagerer med TRP-kanalene (figur 4A [nederst]).

PDA stammer fra forskjellen i mengden fotopigment i forhold til arrestin (ARR2), som binder og avslutter M-aktivitet 19,20,21 (figur 1A). I Drosophila fotoreceptorer er mengden av fotopigmentet omtrent fem ganger større enn mengden ARR2¹⁹. Dermed er ARR2-nivåene utilstrekkelige til å inaktivere alle M-molekylene som genereres av en stor netto fotokonvertering av R til M, og etterlater et overskudd av M konstant aktivt i mørket 17,19,20,22,23. Denne mekanismen forklarer eliminering av PDA-responsen ved mutasjoner eller ved karotenoid deprivasjon^24,25, noe som forårsaker en reduksjon i fotopigmentnivået, men påvirker ikke arrestinnivået. Videre redegjør denne forklaringen også for fenotypene av null ARR2 (arr2³) mutant allel²¹, hvor PDA kunne oppnås ved ~10 ganger dimmer blå lysintensiteter 19,20,21 (figur 4B,C). PDA er ikke et unikt trekk ved fluefotoreceptorer, og det vises i alle testede arter som har mørk stabil M med et absorpsjonsspektrum som er forskjellig fra R-tilstanden, noe som muliggjør tilstrekkelig fotokonvertering av fotopigmentet fra R til M-tilstanden. En grundig undersøkt art der PDA-fenomenologien ble oppdaget, er rur (Balanus) fotoreseptor, der absorpsjonsspekteret til R-tilstanden er i en lengre bølgelengde enn M-tilstanden² (figur 3B). Følgelig, i motsetning til situasjonen i fluen, i rur, induserer oransje-rødt lys en PDA, mens blått lys undertrykker PDA².

Den tidlige reseptorpotensialprotokollen (ERP) utnytter ladningsforskyvningen som oppstår under R- eller M-aktivering. Det visuelle pigmentet er en integrert del av overflatemembranen i signalkammeret til både vertebrat og hvirvelløse membraner³. Følgelig er aktiveringsprosessen der fotopigmentmolekylene endres fra en mellomtilstand til den neste ledsaget av en ladningsforskyvning ^4,26. Ettersom fotopigmentmolekylene er elektrisk justert parallelt med membrankapasitansen⁴, genererer en rask synkronisert konformasjonsendring en rask polarisasjonsendring av overflatemembranen, som i fluer forekommer i signalrommet som består av en stabel på ~ 30.000-50.000 mikrovilli kalt rhabdomere. Denne polariseringen utlades deretter passivt gjennom membrankapasitansen i cellelegemet til cellemembranen er like polarisert. ERP er det ekstracellulære opptaket av ladningsforskyvningen. Den intracellulært registrerte ERP manifesterer den ekstracellulære ERP integrert av tidskonstanten til cellemembranen ^4,27,28. Strømmen aktivert av den visuelle pigmentladningsforskyvningen kunne også måles i helcellespenningklemmeopptak^29,30 (figur 5A-D), med den største fordelen (i tidlig reseptorstrøm (ERC) opptak) for å minimere effekten av membrankapasitans på signalets kinetikk.

Protokolldelen beskriver hvordan man utfører ERG-målinger fra Drosophila eye⁹ og ERC-målinger ved helcelleopptak fra Drosophila isolert ommatidia^31,32. Vi beskriver også spesifikke protokoller som brukes til å undersøke fototransduksjon generelt og fotopigmenter spesielt.

Protocol

1. Måling av intensitetsresponsforholdet, langvarig depolariserende etterpotensiell (PDA) og det tidlige reseptorpotensialet (ERP) ved bruk av elektroretinogrammet Egnede oppdrettsforhold for D. melanogaster forberedelse Raise D. melanogaster fluer i flasker som inneholder standard gul mais inneholder mat i en inkubator holdt ved en temperatur på 24 ° C og i en 12 timers mørk / lys syklus Hold flueflaskene i mørket minst 24 timer før eksperimentet.</li…

Representative Results

Figur 2 eksemplifiserer robustheten og brukervennligheten ved bruk av ERG-teknikken. Den er robust fordi den registreres i den nesten intakte fluen ved en enkel teknikk for ekstracellulære spenningsopptak som krever et enkelt elektrofysiologisk oppsett. Robustheten manifesteres ved å oppnå opptak av lysresponser med relativt store amplituder (i millivoltområdet) selv når mutasjoner sterkt reduserer eller forvrenger lysresponsen. Derfor kan selv en uerfaren eksperimenterer bruke det svæ…

Discussion

Den største fordelen med å bruke Drosophila fotoreseptorpreparatet er dets tilgjengelighet, enkelheten og nøyaktigheten av lysstimulering, og viktigst av alt, evnen til å anvende kraften i molekylær genetikk⁷. Omfattende genetiske studier har etablert Drosophila som et ekstremt nyttig modellsystem for genetisk disseksjon av komplekse biologiske prosesser⁷. Den relativt enkle strukturen til Drosophila-genomet (bestående av bare fire kromosome…

Materials

1 mL syringe with elongated tip			Figure 6M
1 rough tweezers		Dumont #5, Standard	0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter	Molecular Device	Digidata 1200	Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier	Almost perfect electronics		Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table	Newport	VW-3036-OPT-01	Figure 7H
Capillaries	Harvard Apparatus	Borosilicate glass capillaries	1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex	Molecular Device		Software
CO2 tank
Cold light source	Schott	KL1500 LCD	Figure 6C
Delicate wipers	Kimtech		Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder			Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage	Home made		Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color)	Schott	OG590, Edge filter	Figure 7S
Filter (Color)	Schott	BP450/40 nm	Figure 7S
Filter (Color)	Blazers	550 nm	Figure 7S
Filter (Color) for cold light source	Schott	RG630	Figure 6C
Filter (Heat)	Schott	KG3	Figure 7S
Filters (Neutral density filter)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figure 7S
Flash Lamp system	Honeywell		Figure 7U
Fly sleeper system with injector	Inject + matic		Figure 6A-B
Lamp power supply	PTI	LPS-220	Figure 7W
Light detector	Home made		Phototransistor (Figure 7O)
Light guide			3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source			High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax	Home made		Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies	Home made		Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage	Almost perfect electronics		Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulator (mechanical fine)	Leitz Microsystems	Leitz Mechanical Micromanipulator	Figure 7F
pCLAMP	Molecular Device		Software
Petri dish			60 mm
Pulse generator	AMPI	Master 8	Figure 7A
Redux cream for electrocardiography	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crème
Shutter driver	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Single Channel Uni-stable	Figure 7V
Shutter system	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figure 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament			0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope	Nikon	SMZ-2B	Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope	Wild	Wild M5	With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters	Millex		22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller	Sutter/ Narishige	Model P-97/PP-830	Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater	Home made		See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figure 7X