מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה
Summary
פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה קונפוקלית לזיהוי שלושה מצבי איחוי בתאי כרומפין של יותרת הכליה בקר. מצבי היתוך אלה כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבוביות שנפתחו, ו-3) היתוך-כיווץ, הכולל התכווצות שלפוחית מתמזגת.
Abstract
פתיחת נקבוביות היתוך דינמיות וסגירתן מתווכות אקסוציטוזה ואנדוציטוזה וקובעות את הקינטיקה שלהן. כאן, הוא מודגם בפירוט כיצד נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם רישום מהדק טלאי כדי לזהות שלושה מצבי היתוך בתאי כרומפין יותרת הכליה של התרבית הראשונית. שלושת מצבי ההיתוך כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבובית שנפתחה, ו-3) היתוך-כיווץ, הכרוך בהתכווצות של פרופיל צורת Ω שנוצר על ידי היתוך עד שהוא מתמזג לחלוטין בקרום הפלזמה.
כדי לזהות מצבי היתוך אלה, קרום הפלזמה סומן על ידי ביטוי יתר של mNeonGreen המחובר לתחום PH של פוספוליפאז C δ (PH-mNG), הנקשר לפוספטידילינוזיטול-4,5-ביספוספט (PtdIns(4,5)P2) בעלון הפונה לציטוזול של קרום הפלזמה; שלפוחיות היו עמוסות עם נוירוטרנסמיטר כוזב פלואורסצנטי FFN511 כדי לזהות שחרור תוכן שלפוחית; ואטו 655 נכלל בתמיסת האמבטיה כדי לזהות סגירת נקבוביות היתוך. שלוש בדיקות פלואורסצנטיות אלה צולמו בו-זמנית במהירות של כ-20-90 אלפיות השנייה לפריים בתאי כרומפין חיים כדי לזהות פתיחת נקבוביות היתוך, שחרור תוכן, סגירת נקבוביות היתוך ושינויים בגודל השלפוחית. שיטת הניתוח מתוארת כדי להבחין בין שלושה מצבי היתוך לבין מדידות פלואורסצנטיות אלה. השיטה המתוארת כאן יכולה, באופן עקרוני, לחול על תאים מפרישים רבים מעבר לתאי כרומפין.
Introduction
היתוך ממברנה מתווך תפקודים ביולוגיים רבים, כולל העברה סינפטית, הומאוסטזיס של גלוקוז בדם, תגובה חיסונית וכניסה ויראלית 1,2,3. אקסוציטוזה, הכוללת איחוי שלפוחית בקרום הפלזמה, משחררת נוירוטרנסמיטורים והורמונים כדי להשיג פונקציות חשובות רבות, כגון פעילויות רשת עצבית. היתוך פותח נקבובית לשחרור תכולת השלפוחית, ולאחר מכן הנקבובית עשויה להיסגר כדי לאחזר את שלפוחית ההתמזגות, המכונה נשיקה והפעלה 1,4. ניתן למדוד גם את פתיחת נקבוביות ההיתוך הבלתי הפיכה וגם את פתיחת נקבוביות ההיתוך ההפוכה באמצעות הקלטות קיבוליות המחוברות לתאים בשילוב עם הקלטות מוליכות נקבוביות היתוך של נקבוביות היתוך שלפוחית בודדת.
זה מתפרש לעתים קרובות כמשקף היתוך של קריסה מלאה, הכולל התרחבות של ההיתוך עד שיטוח של שלפוחית ההתמזגות, ונשיקה וריצה, הכוללת פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, בהתאמה 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . מחקרי הדמיה אחרונים של דלדול פליטה קונפוקלית ומעוררת (STED) בתאי כרומפין צפו ישירות בפתיחת נקבוביות היתוך וסגירתן (נשיקה וריצה, הנקראת גם היתוך קרוב), פתיחת נקבוביות היתוך השומרת על צורת Ω עם נקבובית פתוחה במשך זמן רב, המכונה היתוך שהייה, וכיווץ שלפוחית ההתמזגות עד להשלמת התמזגותה עם קרום הפלזמה, המחליף היתוך קריסה מלאה למיזוג שלפוחית התמזגות עם קרום הפלזמה4, 8,14,15,16,17.
בתאי עצב, פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך זוהו עם הדמיה המציגה שחרור של נקודות קוונטיות הטעונות מראש בשלפוחיות גדולות יותר מנקבוביות ההיתוך ועם מדידות מוליכות נקבוביות היתוך בפני שחרור של מסופי עצבים 5,18,19. תאי כרומפין יותרת הכליה נמצאים בשימוש נרחב כמודל לחקר אקסו ואנדוציטוזה20,21. אף על פי שתאי כרומפין מכילים בועיות גדולות בעלות ליבה צפופה, בעוד שסינפסות מכילות בועיות סינפטיות קטנות, חלבוני האקסוציטוזה והאנדוציטוזה בתאי כרומפין וסינפסות מקבילים למדי ל-10,11,12,20,21,22,23.
כאן מתוארת שיטה למדידת שלושת מצבי ההיתוך האלה באמצעות שיטת הדמיה קונפוקלית בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה בתאי כרומפין יותרת הכליה בקר (איור 1). שיטה זו כוללת העמסה של נוירוטרנסמיטורים כוזבים פלואורסצנטיים (FFN511) לתוך שלפוחית כדי לזהות אקסוציטוזה; תוספת של Atto 655 (A655) בתמיסת האמבטיה כדי למלא את פרופיל צורת Ω שנוצר על ידי היתוך, ותיוג של קרום הפלזמה עם תחום PH של פוספוליפאז C δ (PH), הנקשר ל- PtdIns(4,5)P2 בקרום הפלזמה 8,15,24. ניתן לזהות דינמיקה של נקבוביות היתוך באמצעות שינויים בעוצמות פלואורסצנטיות שונות. למרות שהיא מתוארת עבור תאי כרומפין, העיקרון של שיטה זו המתוארת כאן יכול להיות מיושם באופן נרחב על תאים מפרישים רבים הרבה מעבר לתאי כרומפין.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית מתוארת כדי לזהות את הדינמיקה של נקבוביות היתוך ושחרור משדרים, כמו גם שלושה מצבי היתוך, היתוך קרוב, היתוך שהייה ואיחוי התכווצות בתאי כרומפין יותרת הכליה בקר 4,24. מתוארת שיטה אלקטרופיזיולוגית לדה-פולריזציה של התא ובכך לעורר א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לתוכניות המחקר התוך-גופיות של NINDS (ZIA NS003009-13 ו- ZIA NS003105-08) על התמיכה בעבודה זו.
Materials
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 1.1214E+10 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
References
- Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
- Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
- Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
- Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
- Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
- Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
- Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
- Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
- Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
- Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
- Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
- Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
- Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
- Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
- Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
- Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
- Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).
- Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
- O’Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
- Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
- Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
- Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).
- Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).
