Microscopia confocale per misurare tre modalità di dinamica dei pori di fusione nelle cellule cromaffini surrenali
Summary
Questo protocollo descrive una tecnica di imaging confocale per rilevare tre modalità di fusione nelle cellule cromaffini surrenali bovine. Queste modalità di fusione includono 1) fusione ravvicinata (chiamata anche kiss-and-run), che coinvolge l’apertura e la chiusura dei pori di fusione, 2) la fusione di soggiorno, che coinvolge l’apertura dei pori di fusione e il mantenimento del poro aperto, e 3) la fusione termoretraibile, che coinvolge il restringimento delle vescicole fuse.
Abstract
L’apertura e la chiusura dinamica dei pori di fusione mediano l’esocitosi e l’endocitosi e ne determinano la cinetica. Qui, è dimostrato in dettaglio come la microscopia confocale è stata utilizzata in combinazione con la registrazione patch-clamp per rilevare tre modalità di fusione nelle cellule surrenali surrenali bovine di coltura primaria. Le tre modalità di fusione includono 1) fusione ravvicinata (chiamata anche kiss-and-run), che coinvolge l’apertura e la chiusura dei pori di fusione, 2) la fusione di soggiorno, che coinvolge l’apertura dei pori di fusione e il mantenimento del poro aperto, e 3) la fusione di restringimento, che comporta il restringimento del profilo a forma di Ω generato dalla fusione fino a quando non si fonde completamente sulla membrana plasmatica.
Per rilevare queste modalità di fusione, la membrana plasmatica è stata etichettata sovraesprimendo mNeonGreen attaccato al dominio PH della fosfolipasi C δ (PH-mNG), che si lega al fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato (PtdIns(4,5)P2) sul foglietto rivolto verso il citosol della membrana plasmatica; le vescicole sono state caricate con il falso neurotrasmettitore fluorescente FFN511 per rilevare il rilascio di contenuto vescicolare; e Atto 655 è stato incluso nella soluzione del bagno per rilevare la chiusura dei pori di fusione. Queste tre sonde fluorescenti sono state fotografate simultaneamente a ~ 20-90 ms per fotogramma in cellule cromaffini vive per rilevare l’apertura dei pori di fusione, il rilascio di contenuto, la chiusura dei pori di fusione e la fusione dei cambiamenti delle dimensioni delle vescicole. Il metodo di analisi è descritto per distinguere tre modalità di fusione da queste misurazioni di fluorescenza. Il metodo qui descritto può, in linea di principio, applicarsi a molte cellule secretorie oltre le cellule cromaffini.
Introduction
La fusione di membrana media molte funzioni biologiche, tra cui la trasmissione sinaptica, l’omeostasi della glicemia, la risposta immunitaria e l’ingresso virale 1,2,3. L’esocitosi, che coinvolge la fusione delle vescicole sulla membrana plasmatica, rilascia neurotrasmettitori e ormoni per ottenere molte funzioni importanti, come le attività della rete neuronale. La fusione apre un poro per rilasciare il contenuto vescicolare, dopo di che il poro può chiudersi per recuperare la vescicola di fusione, che è chiamata kiss-and-run 1,4. Sia l’apertura irreversibile che reversibile dei pori di fusione può essere misurata con registrazioni di capacità collegate a celle combinate con registrazioni di conduttanza dei pori di fusione di fusione di singole vescicole.
Questo è spesso interpretato come riflesso della fusione a collasso completo, che comporta la dilatazione della fusione fino all’appiattimento della vescicola di fusione, e il bacio e la corsa, che comporta l’apertura e la chiusura dei pori di fusione, rispettivamente 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Recenti studi di imaging confocale e sted (STED) di emissioni confocali e stimolate in cellule cromaffini hanno osservato direttamente l’apertura e la chiusura dei pori di fusione (kiss-and-run, chiamata anche fusione ravvicinata), l’apertura dei pori di fusione che mantiene una forma Ω con un poro aperto per lungo tempo, definita fusione di soggiorno, e il restringimento della vescicola fondente fino a quando non si fonde completamente con la membrana plasmatica, che sostituisce la fusione della fusione delle vescicole con la membrana plasmatica4, 8,14,15,16,17.
Nei neuroni, l’apertura e la chiusura dei pori di fusione sono state rilevate con l’imaging che mostra il rilascio di punti quantici precaricati in vescicole più grandi del poro di fusione e con misurazioni della conduttanza dei pori di fusione sulla faccia di rilascio dei terminali nervosi 5,18,19. Le cellule cromaffini surrenali sono ampiamente utilizzate come modello per lo studio dell’eso- ed endocitosi20,21. Sebbene le cellule cromaffini contengano grandi vescicole a nucleo denso, mentre le sinapsi contengono piccole vescicole sinaptiche, le proteine di esocitosi ed endocitosi nelle cellule cromaffini e nelle sinapsi sono abbastanza analoghe 10,11,12,20,21,22,23.
Qui, viene descritto un metodo per misurare queste tre modalità di fusione utilizzando un metodo di imaging confocale combinato con l’elettrofisiologia nelle cellule cromaffini surrenali bovine (Figura 1). Questo metodo prevede il caricamento di falsi neurotrasmettitori fluorescenti (FFN511) nelle vescicole per rilevare l’esocitosi; aggiunta di Atto 655 (A655) nella soluzione bagno per riempire il profilo a forma di Ω generato dalla fusione ed etichettatura della membrana plasmatica con il dominio PH della fosfolipasi C δ (PH), che si lega a PtdIns(4,5)P2 alla membranaplasmatica 8,15,24. La dinamica dei pori di fusione può essere rilevata attraverso cambiamenti in diverse intensità fluorescenti. Sebbene descritto per le cellule cromaffini, il principio di questo metodo qui descritto può essere applicato ampiamente a molte cellule secretorie ben oltre le cellule cromaffini.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viene descritto un metodo di imaging microscopico confocale per rilevare la dinamica del rilascio dei pori di fusione e del trasmettitore, nonché tre modalità di fusione, fusione ravvicinata, fusione di permanenza e fusione di restringimento nelle cellule cromaffini surrenali bovine 4,24. Viene descritto un metodo elettrofisiologico per depolarizzare la cellula e quindi evocare l’eso- e l’endocitosi. L’elaborazione sistematica delle immagini confocali fornisce …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i programmi di ricerca intramurale NINDS (ZIA NS003009-13 e ZIA NS003105-08) per aver sostenuto questo lavoro.
Materials
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 1.1214E+10 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
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