Microscopia Confocal para medir três modos de dinâmica de poros de fusão em células adrenal chromaffin
Summary
Este protocolo descreve uma técnica de imagem confocal para detectar três modos de fusão em células adrenals de chromaffin bovinas. Esses modos de fusão incluem 1) close-fusion (também chamado de kiss-and-run), envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, 2) stay-fusion, envolvendo abertura de poros de fusão e manutenção do poro aberto, e 3) redução de fusão, envolvendo encolhimento vesícula fundido.
Abstract
Abertura dinâmica de poros de fusão e fechamento mediam exocitese e endocitose e determinam sua cinética. Aqui, é demonstrado em detalhes como a microscopia confocal foi usada em combinação com a gravação de grampo de remendo para detectar três modos de fusão em células adrenal adrenal de cultura primária. Os três modos de fusão incluem 1) fusão de perto (também chamada de kiss-and-run), envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, 2) estadia-fusão, envolvendo abertura de poros de fusão e manutenção do poro aberto, e 3) redução de fusão, envolvendo encolhimento do perfil de forma Ω gerada por fusão até que se funda completamente na membrana plasmática.
Para detectar esses modos de fusão, a membrana plasmática foi rotulada pela superexpressão mNeonGreen anexada ao domínio PH de fosfolipase C δ (PH-mNG), que se liga ao fosfaticicylinositol-4,5-bisfosfato (PtdIns(4,5)P2) no folheto voltado para o citosol da membrana plasmática; vesículas foram carregadas com o falso neurotransmissor fluorescente FFN511 para detectar a liberação de conteúdo vesicular; e Atto 655 foi incluído na solução de banho para detectar o fechamento de poros de fusão. Estas três sondas fluorescentes foram imagens simultaneamente a ~20-90 ms por quadro em células de cromaffin ao vivo para detectar abertura de poros de fusão, liberação de conteúdo, fechamento de poros de fusão e mudanças de tamanho vesícula. O método de análise é descrito para distinguir três modos de fusão dessas medidas de fluorescência. O método aqui descrito pode, em princípio, aplicar-se a muitas células secretas além das células cromafinas.
Introduction
A fusão de membranas media muitas funções biológicas, incluindo transmissão sináptica, homeostase de glicemia, resposta imune e entrada viral 1,2,3. A excitose, envolvendo a fusão vesícula na membrana plasmática, libera neurotransmissores e hormônios para alcançar muitas funções importantes, como atividades da rede neuronal. Fusion abre um poro para liberar conteúdo vesicular, após o qual o poro pode fechar para recuperar a vesícula fusível, que é chamada de beijo e fuga 1,4. Tanto a abertura irreversível quanto a reversível dos poros de fusão podem ser medidas com gravações de capacitância ligadas a células combinadas com gravações de conduance de poros de fusão de fusão única de fusão vesícula.
Isso é frequentemente interpretado como reflexo da fusão de colapso total, envolvendo a dilatação da fusão até o achatamento da vesícula fusível, e beijo-e-fuga, envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, respectivamente 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Estudos recentes de esgotamento de emissões confocal e estimulados (STED) em células cromafina observaram diretamente abertura e fechamento de poros de fusão (beijo-e-fuga, também chamada de fusão estreita), abertura de poros de fusão que mantém uma forma de Ω com um poro aberto por um longo tempo, denominada fusão de estadia, e encolhimento da vesícula fusória até que se funda com a membrana plasmática, que substitui a fusão de colapso total para a fusão de vesículas fusíveis com a membrana plasmática4, 8,14,15,16,17.
Nos neurônios, a abertura e o fechamento de poros de fusão foram detectados com imagens mostrando a liberação de pontos quânticos pré-carregados em vesículas maiores que o poro de fusão e com medições de condutância de poros de fusão na face de liberação dos terminais nervosos 5,18,19. As células cromafinas adrenal são amplamente utilizadas como modelo para o estudo da exo-e endocitose20,21. Embora as células cromatofinas contenham grandes vesículas densas, enquanto as sinapses contêm pequenas vesículas sinapáticas, as proteínas excitose e endocitose em células cromafinas e sinapses são bastante análogas 10,11,12,20,21,22,23.
Aqui, um método é descrito para medir esses três modos de fusão usando um método de imagem confocal combinado com eletrofisiologia em células adrenal chromaffin bovina (Figura 1). Este método envolve o carregamento de falsos neurotransmissores fluorescentes (FFN511) em vesículas para detectar exocitose; adição de Atto 655 (A655) na solução de banho para preencher o perfil de forma Ω gerado pela fusão, e rotulagem da membrana plasmática com o domínio PH de fosfolipase C δ (PH), que se liga a PtdIns(4,5)P2 na membrana plasmática 8,15,24. A dinâmica dos poros de fusão pode ser detectada através de alterações em diferentes intensidades fluorescentes. Embora descrito para células cromafinas, o princípio deste método descrito aqui pode ser amplamente aplicado a muitas células secretary muito além das células cromafinas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um método de imagem microscópica confocal é descrito para detectar a dinâmica da liberação de poros de fusão e transmissor, bem como três modos de fusão, fusão de perto, fusão de estadia e redução de fusão em células adrenalrnafina bovina 4,24. Um método eletrofisiológico para despolarizar a célula e, assim, evocar exo-e endocitose é descrito. O processamento sistemático de imagens confocal fornece informações sobre diferentes modos de compo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos Programas de Pesquisa Intramuros do NINDS (ZIA NS003009-13 e ZIA NS003105-08) por apoiarem este trabalho.
Materials
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 1.1214E+10 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
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