Konfokale Mikroskopie zur Messung von drei Modi der Fusionsporendynamik in Nebennierenchromaffinzellen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein konfokales Bildgebungsverfahren zum Nachweis von drei Fusionsmodi in rindischen Nebennierenchromaffinzellen. Diese Fusionsmodi umfassen 1) Close-Fusion (auch Kiss-and-Run genannt), bei der sich die Fusionspore öffnet und schließt, 2) Stay-Fusion, bei der die Fusionspore geöffnet und die geöffnete Pore erhalten bleibt, und 3) Shrink-Fusion, einschließlich der Schrumpfung der fusionierten Vesikel.
Abstract
Dynamische Fusionsporenöffnung und -verschluss vermitteln Exozytose und Endozytose und bestimmen deren Kinetik. Hier wird detailliert demonstriert, wie die konfokale Mikroskopie in Kombination mit der Patch-Clamp-Aufzeichnung eingesetzt wurde, um drei Fusionsmodi in Primärkultur-Rindernebennieren-Chromaffinzellen nachzuweisen. Die drei Fusionsmodi umfassen 1) Close-Fusion (auch Kiss-and-Run genannt) mit Fusionsporenöffnung und -verschluss, 2) Stay-Fusion, bei der die Fusionspore geöffnet und die geöffnete Pore erhalten bleibt, und 3) Shrink-Fusion, bei der das fusionserzeugte Ω-Form-Profil geschrumpft wird, bis es vollständig an der Plasmamembran verschmilzt.
Um diese Fusionsmodi nachzuweisen, wurde die Plasmamembran durch Überexpression von mNeonGreen markiert, das mit der PH-Domäne der Phospholipase C δ (PH-mNG) verbunden ist, die an Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PtdIns(4,5)P2) an der Zytosol-zugewandten Packungsbeilage der Plasmamembran bindet; Vesikel wurden mit dem fluoreszierenden falschen Neurotransmitter FFN511 beladen, um die Freisetzung von vesikulärem Inhalt nachzuweisen; und Atto 655 wurde in die Badlösung aufgenommen, um einen Fusionsporenverschluss zu erkennen. Diese drei fluoreszierenden Sonden wurden gleichzeitig mit ~ 20-90 ms pro Bild in lebenden Chromaffinzellen abgebildet, um die Öffnung der Fusionsporen, die Freisetzung von Inhalten, den Fusionsporenverschluss und die Änderung der Fusionsvesikelgröße zu erkennen. Die Analysemethode wird beschrieben, um drei Fusionsmodi von diesen Fluoreszenzmessungen zu unterscheiden. Das hier beschriebene Verfahren kann prinzipiell auf viele sekretorische Zellen jenseits von Chromaffinzellen angewendet werden.
Introduction
Die Membranfusion vermittelt viele biologische Funktionen, einschließlich synaptischer Übertragung, Blutzuckerhomöostase, Immunantwort und viralem Eintritt 1,2,3. Exozytose, bei der die Vesikelfusion an der Plasmamembran stattfindet, setzt Neurotransmitter und Hormone frei, um viele wichtige Funktionen wie neuronale Netzwerkaktivitäten zu erreichen. Fusion öffnet eine Pore, um vesikulären Inhalt freizusetzen, wonach sich die Pore schließen kann, um das fusionierende Vesikel zu erhalten, das als Kiss-and-Run 1,4 bezeichnet wird. Sowohl irreversible als auch reversible Fusionsporenöffnung können mit zellgebundenen Kapazitätsaufzeichnungen in Kombination mit Fusionsporenleitfähigkeitsaufzeichnungen der Einzelvesikelfusion gemessen werden.
Dies wird oft so interpretiert, dass es die vollständige Kollapsfusion widerspiegelt, bei der die Fusion bis zur Abflachung des Schmelzvesikels dilatiert wird, und Kiss-and-Run, bei dem die Fusionsporen geöffnet und geschlossen werden, bzw. 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Jüngste konfokale und stimulierte Emissionsdepletionsstudien (STED) in chromaffinen Zellen beobachteten direkt die Öffnung und den Verschluss der Fusionsporen (Kiss-and-Run, auch Close-Fusion genannt), die Fusionsporenöffnung, die lange Zeit eine Ω-Form mit einer offenen Pore beibehält, die als Stay-Fusion bezeichnet wird, und das Schrumpfen des Fusionsvesikels, bis es vollständig mit der Plasmamembran verschmilzt, die die vollständige Kollapsfusion für die Verschmelzung von Fusionsvesikeln mit der Plasmamembran4 ersetzt. 8,14,15,16,17.
In Neuronen wurde die Öffnung und der Verschluss der Fusionsporen mit Bildgebung nachgewiesen, die die Freisetzung von Quantenpunkten zeigt, die in Vesikeln vorgeladen sind, die größer als die Fusionspore sind, und mit Fusionsporenleitfähigkeitsmessungen an der Freisetzungsfläche von Nerventerminals 5,18,19. Nebennierenchromaffinzellen werden häufig als Modell für die Untersuchung von Exo- und Endozytoseverwendet 20,21. Obwohl Chromaffinzellen große Vesikel mit dichtem Kern enthalten, während Synapsen kleine synaptische Vesikel enthalten, sind die Exozytose- und Endozytoseproteine in chromaffinen Zellen und Synapsen ziemlich analog 10,11,12,20,21,22,23.
Hier wird ein Verfahren beschrieben, um diese drei Fusionsmodi mit einem konfokalen Bildgebungsverfahren in Kombination mit Elektrophysiologie in Rindernebennieren-Chromaffinzellen zu messen (Abbildung 1). Diese Methode beinhaltet das Laden von fluoreszierenden falschen Neurotransmittern (FFN511) in Vesikel, um Exozytose zu erkennen; Zugabe von Atto 655 (A655) in der Badlösung, um das fusionserzeugte Ω-Form-Profil zu füllen, und Markierung der Plasmamembran mit der PH-Domäne der Phospholipase C δ (PH), die an PtdIns(4,5)P2 an der Plasmamembran 8,15,24 bindet. Die Dynamik der Fusionsporen kann durch Änderungen verschiedener Fluoreszenzintensitäten nachgewiesen werden. Obwohl für Chromaffinzellen beschrieben, kann das hier beschriebene Prinzip dieser Methode weit über Chromaffinzellen hinaus auf viele sekretorische Zellen angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein konfokales mikroskopisches Bildgebungsverfahren wird beschrieben, um die Dynamik der Fusionsporen- und Transmitterfreisetzung sowie drei Fusionsmodi, Close-Fusion, Stay-Fusion und Shrink-Fusion in bovinen Nebennieren-Chromaffin-Zellenzu erkennen 4,24. Es wird eine elektrophysiologische Methode beschrieben, um die Zelle zu depolarisieren und dadurch Exo- und Endozytose hervorzurufen. Die systematische konfokale Bildverarbeitung liefert Informationen über vers…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den NINDS Intramural Research Programs (ZIA NS003009-13 und ZIA NS003105-08) für die Unterstützung dieser Arbeit.
Materials
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 1.1214E+10 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
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