Étude de la régénération tissulaire sans cicatrices dans les cornées de poussins embryonnaires blessés
Summary
Le présent protocole démontre les différentes étapes impliquées dans la blessure de la cornée d’un poussin embryonnaire in ovo. Les cornées régénérantes ou entièrement restaurées peuvent être analysées pour leur potentiel de régénération à l’aide de diverses techniques cellulaires et moléculaires après la procédure de blessure.
Abstract
Les plaies cornéennes embryonnaires de poussins présentent une capacité remarquable à se régénérer complètement et rapidement, tandis que les cornées blessées adultes subissent une perte de transparence due à des cicatrices fibrotiques. L’intégrité tissulaire des cornées embryonnaires blessées est intrinsèquement restaurée sans formation de cicatrice détectable. Compte tenu de son accessibilité et de sa facilité de manipulation, l’embryon de poussin est un modèle idéal pour étudier la réparation des plaies cornéennes sans cicatrice. Ce protocole démontre les différentes étapes impliquées dans la blessure de la cornée d’un poussin embryonnaire en ovo. Tout d’abord, les œufs sont fenêtrés au début de l’âge embryonnaire pour accéder à l’œil. Deuxièmement, une série de manipulations in ovo physiques des membranes extraembryonnaires sont effectuées pour assurer le maintien de l’accès à l’œil jusqu’aux stades ultérieurs de développement, correspondant au moment où les trois couches cellulaires de la cornée sont formées. Troisièmement, les plaies cornéennes linéaires qui pénètrent dans la couche épithéliale externe et le stroma antérieur sont fabriquées à l’aide d’un couteau microchirurgical. Le processus de régénération ou les cornées entièrement restaurées peuvent être analysés pour le potentiel de régénération en utilisant diverses techniques cellulaires et moléculaires après la procédure de blessure. Les études à ce jour utilisant ce modèle ont révélé que les cornées embryonnaires blessées présentent une activation de la différenciation kératocytaire, subissent un remodelage coordonné des protéines ECM à leur macrostructure tridimensionnelle native et sont réintricées de manière adéquate par les nerfs sensoriels cornéens. À l’avenir, l’impact potentiel des facteurs endogènes ou exogènes sur le processus de régénération pourrait être analysé dans la guérison des cornées en utilisant des techniques de biologie du développement, telles que la greffe de tissus, l’électroporation, l’infection rétrovirale ou l’implantation de billes. La stratégie actuelle identifie le poussin embryonnaire comme un paradigme expérimental crucial pour élucider les facteurs moléculaires et cellulaires coordonnant la cicatrisation des plaies cornéennes sans cicatrice.
Introduction
La cornée est le tissu transparent et le plus externe de l’œil qui transmet et réfracte la lumière propice à l’acuité visuelle. Dans la cornée adulte, des dommages ou une infection du stroma cornéen entraînent une réponse rapide et robuste à la cicatrisation des plaies caractérisée par une prolifération kératocytaire, une fibrose, une inflammation accrue conduisant à une apoptose induite par les cytokines, la génération de myofibroblastes réparateurs et un remodelage global de la matrice extracellulaire (ECM)1,2 . Après une blessure, une telle réparation du tissu cornéen entraîne un tissu cicatriciel opaque qui réduit la transparence cornéenne et obstrue le passage de la lumière, déformant ainsi la vision et, dans les cas les plus graves, conduisant à la cécité cornéenne3. Ainsi, il est clairement nécessaire de développer des modèles animaux fiables pour aborder les complexités de la cicatrisation des plaies et identifier les facteurs cellulaires et moléculaires responsables de la fermeture des plaies et de la régénération des tissus.
À ce jour, la plupart des études portant sur la cicatrisation des plaies cornéennes ont utilisédes modèles animaux postnatals 4 ou adultes 1,2,5,6,7. Bien que ces études aient conduit à une avancée significative dans la compréhension de la réponse de cicatrisation des plaies cornéennes et des mécanismes sous-jacents à la formation de cicatrices, les tissus cornéens endommagés dans ces modèles de guérison ne parviennent pas à se régénérer complètement, limitant ainsi leur utilité pour identifier les facteurs moléculaires et les mécanismes cellulaires responsables de la récapitulation complète de la morphologie et de la structure de la cornée après une blessure. En revanche, les plaies fœtales générées avec un couteau dans la cornée embryonnaire du poussin possèdent une capacité intrinsèque à guérir complètement de manière sans cicatrice8. Plus précisément, la cornée embryonnaire du poussin présente une régénération non fibrotique avec la récapitulation complète de la structure de la matrice extracellulaire et des modèles d’innervation 8,9.
Le présent protocole décrit une séquence d’étapes impliquées dans la blessure de la cornée d’un poussin embryonnaire in ovo. Tout d’abord, les ovules sont fenêtrés au début de l’âge embryonnaire pour faciliter l’accès à l’embryon. Deuxièmement, une série de manipulations in ovo physiques des membranes extraembryonnaires sont effectuées pour assurer le maintien de l’accès à l’œil à des stades ultérieurs de développement, correspondant au moment où les trois couches cellulaires de la cornée sont formées et où la blessure est souhaitée. Troisièmement, les incisions linéaires de la cornée centrale pénétrant à travers l’épithélium cornéen et dans le stroma antérieur sont faites à l’aide d’un couteau microchirurgical. Le processus de régénération ou les cornées entièrement restaurées peuvent être analysés pour le potentiel de régénération en utilisant diverses techniques cellulaires et moléculaires après la procédure de blessure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le poussin est un système modèle idéal pour étudier la réparation des plaies cornéennes fœtales et sans cicatrice. Contrairement aux mammifères, le poussin est facilement accessible tout au long du développement en utilisant les stratégies in ovo8 ou ex ovo 24. La cornée embryonnaire du poussin est beaucoup plus grande que les cornées de rongeurs, avec près de 50% du volume crânien dédié à l’œil25, ce qui la rend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de développement artistique et savant de l’Illinois Wesleyan University à TS et financé en partie par NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
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