Investigando la regeneración de tejidos sin cicatrices en córneas embrionarias de pollitos heridos
Summary
El presente protocolo demuestra los diferentes pasos involucrados en la herida de la córnea de un pollito embrionario en ovo. Las córneas regeneradoras o completamente restauradas se pueden analizar para determinar su potencial regenerativo utilizando diversas técnicas celulares y moleculares después del procedimiento de herida.
Abstract
Las heridas corneales embrionarias de los pollitos muestran una notable capacidad para regenerarse completa y rápidamente, mientras que las córneas heridas adultas experimentan una pérdida de transparencia debido a la cicatrización fibrótica. La integridad tisular de las córneas embrionarias lesionadas se restaura intrínsecamente sin formación de cicatrices detectables. Dada su accesibilidad y facilidad de manipulación, el embrión de pollito es un modelo ideal para estudiar la reparación de heridas corneales sin cicatrices. Este protocolo demuestra los diferentes pasos involucrados en la herida de la córnea de un pollito embrionario en ovo. Primero, los óvulos se ventanan a edades embrionarias tempranas para acceder al ojo. En segundo lugar, se realizan una serie de manipulaciones in ovo físicas a las membranas extraembrionarias para garantizar que el acceso al ojo se mantenga a través de etapas posteriores de desarrollo, correspondientes a cuando se forman las tres capas celulares de la córnea. En tercer lugar, las heridas lineales de la córnea que penetran en la capa epitelial externa y el estroma anterior se realizan con un cuchillo microquirúrgico. El proceso de regeneración o las córneas completamente restauradas se pueden analizar para determinar su potencial regenerativo utilizando diversas técnicas celulares y moleculares después del procedimiento de herida. Los estudios realizados hasta la fecha utilizando este modelo han revelado que las córneas embrionarias heridas muestran activación de la diferenciación de queratocitos, se someten a una remodelación coordinada de las proteínas ECM a su macroestructura tridimensional nativa y se vuelven a inervar adecuadamente por los nervios sensoriales corneales. En el futuro, el impacto potencial de los factores endógenos o exógenos en el proceso regenerativo podría analizarse en la curación de córneas mediante el uso de técnicas de biología del desarrollo, como el injerto de tejido, la electroporación, la infección retroviral o la implantación de perlas. La estrategia actual identifica al pollito embrionario como un paradigma experimental crucial para dilucidar los factores moleculares y celulares que coordinan la cicatrización de heridas corneales sin cicatrices.
Introduction
La córnea es el tejido transparente y externo del ojo que transmite y refracta la luz que conduce a la agudeza visual. En la córnea adulta, el daño o la infección del estroma corneal conduce a una respuesta de cicatrización de heridas rápida y robusta caracterizada por proliferación de queratocitos, fibrosis, aumento de la inflamación que conduce a la apoptosis inducida por citoquinas, generación de miofibroblastos reparadores y remodelación general de la matriz extracelular (ECM)1,2 . Después de la lesión, dicha reparación del tejido corneal da como resultado un tejido cicatricial opaco que reduce la transparencia corneal y ocluye el paso de la luz, distorsionando así la visión y, en los casos más graves, dando lugar a la ceguera corneal3. Por lo tanto, existe una clara necesidad de desarrollar modelos animales confiables para abordar las complejidades de la cicatrización de heridas e identificar los factores celulares y moleculares responsables del cierre de heridas y la regeneración de tejidos.
Hasta la fecha, la mayoría de los estudios que examinan la cicatrización de heridas corneales han utilizado modelos postnatales4 o animales adultos 1,2,5,6,7. Si bien estos estudios han llevado a un avance significativo en la comprensión de la respuesta de curación de heridas corneales y los mecanismos subyacentes a la formación de cicatrices, los tejidos corneales dañados en estos modelos de curación no se regeneran por completo, lo que limita su utilidad para identificar los factores moleculares y los mecanismos celulares responsables de recapitular completamente la morfología y la estructura corneal después de la lesión. Por el contrario, las heridas fetales generadas con un cuchillo en la córnea embrionaria del pollito poseen una capacidad intrínseca para sanar completamente de una manera sin cicatrices8. En concreto, la córnea embrionaria del pollito exhibe regeneración no ficbrótica con la recapitulación completa de la estructura de la matriz extracelular y patrones de inervación 8,9.
El presente protocolo describe una secuencia de pasos involucrados en la herida de la córnea de un pollito embrionario en ovo. En primer lugar, los óvulos se bloquean a edades embrionarias tempranas para facilitar el acceso al embrión. En segundo lugar, se realizan una serie de manipulaciones físicas in ovo a las membranas extraembrionarias para garantizar que el acceso al ojo se mantenga a través de etapas posteriores de desarrollo, correspondientes a cuando se forman las tres capas celulares de la córnea y se desea la herida. En tercer lugar, las incisiones lineales de la córnea central que penetran a través del epitelio corneal y en el estroma anterior se realizan con un cuchillo microquirúrgico. El proceso de regeneración o las córneas completamente restauradas se pueden analizar para determinar su potencial regenerativo utilizando diversas técnicas celulares y moleculares después del procedimiento de herida.
Protocol
Representative Results
Discussion
El pollito es un sistema modelo ideal para estudiar la reparación de la herida de la córnea fetal sin cicatrices. A diferencia de los mamíferos, el polluelo es fácilmente accesible durante todo el desarrollo utilizando las estrategias in ovo8 o ex ovo 24. La córnea embrionaria del pollito es mucho más grande que las córneas de los roedores, con casi el 50% del volumen craneal dedicado al ojo25, lo que la hace altamente suscep…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención de Desarrollo Artístico y Académico a través de Illinois Wesleyan University a TS y financiado en parte por NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
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