Embriyonik Yaralı Civciv Kornealarında İzsiz Doku Rejenerasyonunun İncelenmesi
Summary
Mevcut protokol, ovo’daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. Rejenere veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir.
Abstract
Civciv embriyonik kornea yaraları tamamen ve hızlı bir şekilde yenilenmek için dikkate değer bir kapasite gösterirken, yetişkin yaralı kornealar fibrotik skarlaşma nedeniyle şeffaflık kaybı yaşarlar. Yaralı embriyonik korneaların doku bütünlüğü, saptanabilir bir skar oluşumu olmadan içsel olarak restore edilir. Erişilebilirliği ve manipülasyon kolaylığı göz önüne alındığında, civciv embriyosu, yarasız kornea yara onarımını incelemek için ideal bir modeldir. Bu protokol, ovo’daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. İlk olarak, yumurtalar göze erişmek için erken embriyonik yaşlarda pencerelenir. İkincisi, korneanın üç hücresel tabakasının oluştuğu zamana karşılık gelen, gelişimin sonraki aşamalarında göze erişimin korunmasını sağlamak için ekstraembriyonik membranlara bir dizi in ovo fiziksel manipülasyonu gerçekleştirilir. Üçüncüsü, dış epitel tabakasına ve anterior stromaya nüfuz eden lineer kornea yaraları mikrocerrahi bıçak kullanılarak yapılır. Rejenerasyon süreci veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir. Bu modeli kullanarak bugüne kadar yapılan çalışmalar, yaralı embriyonik korneaların keratosit farklılaşmasının aktivasyonunu gösterdiğini, ECM proteinlerinin doğal üç boyutlu makroyapılarına koordineli bir şekilde yeniden şekillendiğini ve kornea duyu sinirleri tarafından yeterince yeniden innerve edildiğini ortaya koymuştur. Gelecekte, endojen veya eksojen faktörlerin rejeneratif süreç üzerindeki potansiyel etkisi, doku aşılama, elektroporasyon, retroviral enfeksiyon veya boncuk implantasyonu gibi gelişimsel biyoloji teknikleri kullanılarak iyileşen kornealarda analiz edilebilir. Mevcut strateji, embriyonik civcivleri, skarsız kornea yara iyileşmesini koordine eden moleküler ve hücresel faktörleri aydınlatmak için çok önemli bir deneysel paradigma olarak tanımlamaktadır.
Introduction
Kornea, görme keskinliğine elverişli ışığı ileten ve kıran gözün şeffaf, en dıştaki dokusudur. Yetişkin korneada, kornea stromasına verilen hasar veya enfeksiyon, keratosit proliferasyonu, fibroz, sitokin kaynaklı apoptozise yol açan inflamasyon artışı, onarım miyofibroblastlarının oluşumu ve hücre dışı matriksin (ECM) genel olarak yeniden şekillenmesi ile karakterize hızlı ve sağlam bir yara iyileşme yanıtına yol açar1,2 . Yaralanmayı takiben, bu tür kornea dokusu onarımı, kornea saydamlığını azaltan ve ışığın geçişini engelleyen, böylece görüşü bozan ve en ciddi vakalarda kornea körlüğüne yol açan opak skar dokusu ile sonuçlanır3. Bu nedenle, yara iyileşmesinin karmaşıklığını ele almak ve yara kapanması ve doku yenilenmesinden sorumlu hücresel ve moleküler faktörleri tanımlamak için güvenilir hayvan modelleri geliştirmeye açık bir ihtiyaç vardır.
Bugüne kadar, kornea yarasının iyileşmesini inceleyen çoğu çalışmada doğum sonrası4 veya yetişkin hayvan modelleri 1,2,5,6,7 kullanılmıştır. Bu çalışmalar kornea yarası iyileşme yanıtının ve skar oluşumunun altında yatan mekanizmaların anlaşılmasında önemli bir ilerlemeye yol açmış olsa da, bu iyileşme modellerindeki hasarlı kornea dokuları tam olarak yenilenememekte, böylece kornea morfolojisinin ve yaralanma sonrası yapının tam olarak özetlenmesinden sorumlu moleküler faktörlerin ve hücresel mekanizmaların tanımlanmasındaki yararlılıklarını sınırlamaktadır. Buna karşılık, embriyonik civciv korneasında bıçakla oluşturulan fetal yaralar, yarasız bir şekilde tamamen iyileşmek için içsel bir kapasiteye sahiptir8. Spesifik olarak, embriyonik civciv korneası, hücre dışı matriks yapısının ve innervasyon paternlerinin tam özetlenmesiyle fibrotik olmayan rejenerasyon sergiler 8,9.
Mevcut protokol, ovo’daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında rol oynayan bir dizi adımı tanımlamaktadır. İlk olarak, embriyoya erişimi kolaylaştırmak için yumurtalar erken embriyonik yaşlarda pencerelenir. İkincisi, korneanın üç hücresel tabakasının oluştuğu ve yaralanmanın istendiği zamana karşılık gelen, gelişimin sonraki aşamalarında göze erişimin korunmasını sağlamak için ekstraembriyonik membranlara bir dizi in ovo fiziksel manipülasyonu gerçekleştirilir. Üçüncü olarak, kornea epitelinden ve anterior stroma içine nüfuz eden lineer santral kornea insizyonları mikrocerrahi bıçak kullanılarak yapılır. Rejenerasyon süreci veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Civciv, fetal, yarasız kornea yara onarımını incelemek için ideal bir model sistemdir. Memelilerin aksine, civciv, ovo 8 veya ex ovo stratejileri24 kullanılarak gelişim boyunca kolayca erişilebilir. Embriyonik civciv korneası, kemirgen kornealarından çok daha büyüktür, kafatası hacminin yaklaşık% 50’si göze25’e adanmıştır ve bu da onu yaralama gibi fiziksel manipülasyonlara oldukça uygun hale getirir. Dahası,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Illinois Wesleyan Üniversitesi aracılığıyla TS’ye verilen bir Sanatsal ve Bilimsel Gelişim hibesi ile desteklenmiş ve kısmen NIH-R01EY022158 (PL) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089 (2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A. The bird’s eye view. American Scientist. 78, 342-353 (1990).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
