Summary

Proteómica de espectrometría de masas guiada por linaje celular en el embrión en desarrollo (rana)

Published: April 21, 2022
doi:

Summary

Aquí describimos una caracterización proteómica basada en espectrometría de masas de linajes celulares con destinos tisulares conocidos en el embrión vertebrado de Xenopus laevis .

Abstract

La caracterización de eventos moleculares a medida que las células dan lugar a tejidos y órganos plantea un potencial para comprender mejor el desarrollo normal y diseñar remedios eficientes para las enfermedades. Las tecnologías que permiten la identificación y cuantificación precisas de diversos tipos y un gran número de proteínas proporcionarían información aún faltante sobre los mecanismos moleculares que orquestan el desarrollo de tejidos y organismos en el espacio y el tiempo. Aquí, presentamos un protocolo basado en espectrometría de masas que permite la medición de miles de proteínas en linajes celulares identificados en embriones de Xenopus laevis (rana). El enfoque se basa en mapas reproducibles de destino celular y métodos establecidos para identificar, etiquetar fluorescentemente, rastrear y muestrear células y su progenie (clones) a partir de este modelo de desarrollo de vertebrados. Después de recolectar el contenido celular utilizando micromuestreo o aislar células por disección o clasificación celular activada por fluorescencia, las proteínas se extraen y procesan para el análisis proteómico ascendente. La cromatografía líquida y la electroforesis capilar se utilizan para proporcionar una separación escalable para la detección y cuantificación de proteínas con espectrometría de masas de alta resolución (HRMS). Se proporcionan ejemplos representativos para la caracterización proteómica de células destinadas al tejido neural. La proteómica HRMS guiada por linaje celular es adaptable a diferentes tejidos y organismos. Es lo suficientemente sensible, específico y cuantitativo para observar la dinámica espacio-temporal del proteoma durante el desarrollo de los vertebrados.

Introduction

Nuestra comprensión de la diferenciación celular y la génesis de tejidos y órganos es el resultado de décadas de elaboradas pantallas específicas de genes y sus productos. Aumentar nuestro conocimiento de todas las biomoléculas y sus cantidades durante eventos celulares importantes ayudaría a desentrañar los mecanismos moleculares que controlan el patrón espacial y temporal del plan corporal de los vertebrados. Las tecnologías que permiten la amplificación molecular y la secuenciación ahora pueden informar rutinariamente sobre un gran número de genes y transcripciones, apoyando estudios basados en hipótesis en investigación biológica básica y traslacional. Para comprender los sistemas en desarrollo, una relación compleja entre la transcripción y la traducción aboga por el análisis directo de múltiples proteínas y sus modificaciones postraduccionales. La proteómica global utilizando sistemas biológicos in vitro, como células madre pluripotentes inducidas, comenzó a delinear mecanismos de inducción tisular 1,2. En organismos complejos, como el embrión vertebrado, el desarrollo se basa en gradientes morfógenos en el contexto del espacio y el tiempo3. De ello se deduce que obtener conocimiento de los cambios proteómicos a medida que las células se diferencian para formar tejidos especializados, como los tejidos neurales, ofrece una clave para desbloquear programas moleculares que controlan el desarrollo normal y defectuoso y guiar la terapéutica de próxima generación.

La rana vertebrada sudafricana (Xenopus laevis) es un modelo bien establecido en biología celular y del desarrollo, neuro y regenerativa. El Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2012 de Sir John Gurdon por el descubrimiento de la pluripotencia del núcleo somático destacó la importancia de este modelo para los descubrimientos en estudios básicos y traslacionales. Los embriones de Xenopus se desarrollan externamente a la madre, facilitando así la manipulación directa de células, clones celulares y expresión génica en varias etapas de desarrollo. La pigmentación asimétrica y las divisiones celulares estereotipadas permitieron el trazado de mapas de destino reproducibles del embrión de 7,8 células de 16-6 y 32 células. Para la proteómica basada en espectrometría de masas de alta resolución (HRMS), las ventajas adicionales del modelo incluyen un tamaño relativamente grande (~ 1 mm de diámetro), que produce un contenido abundante de proteínas para el análisis (~ 130 μg en embriones en etapa de escisión temprana, ~ 10 μg de contenido de proteína en células individuales del embrión de 16 células)9,10.

En la actualidad, HRMS es la tecnología líder de elección para detectar proteínas. Esta tecnología permite la detección y cuantificación directa, sensible y específica de múltiples, generalmente cientos a miles de proteínas diferentes11. La proteómica ascendente de HRMS implica una serie de pasos interconectados. Después de la extracción de la muestra de célula/tejido, las proteínas se digieren con una enzima proteolítica, como la tripsina (proteómica ascendente). Los péptidos resultantes se separan en función de sus diferentes propiedades fisicoquímicas, incluida la hidrofobicidad (cromatografía líquida de fase inversa, LC), la carga neta (cromatografía de intercambio iónico), el tamaño (cromatografía de exclusión de tamaño) o la movilidad electroforética (electroforesis capilar, CE). Los péptidos se cargan (ionizan), típicamente usando ionización por electrospray (ESI), y los iones peptídicos se detectan y secuencian a través de la fragmentación en fase gaseosa por HRMS en tándem. Los datos peptídicos resultantes se asignan al proteoma del organismo que se está estudiando. Con la intensidad de la señal de iones peptídicos específicos de proteínas (proteotípicos) que se correlacionan con la concentración, la cuantificación de proteínas se puede realizar sin etiqueta o basada en etiquetas (cuantificación de multiplexación). La proteómica HRMS proporciona un rico recurso de información sobre el estado molecular del sistema en estudio, lo que permite la generación de hipótesis y estudios funcionales de seguimiento.

Figure 1
Figura 1: Proteómica escalable espaciotemporalmente que permite la proteómica HRMS guiada por linaje celular en el embrión en desarrollo (rana). (A) Visualización de la muestra (1) utilizando un microscopio estereoscópico (2) para la inyección de una célula identificada (recuadro), utilizando una micropipeta fabricada (3) bajo control por una etapa de traslación (4). (B) Muestreo subcelular de la célula D11 izquierda identificada en un embrión de 16 células. (C) Disección de una célula D11 completa de un embrión de 16 células. (D) Trazado fluorescente (verde) de las progenies D111 izquierda y derecha de un embrión de 32 células para guiar la disección del ectodermo neural (NE) en la gástrula (etapa 10) y el aislamiento del tejido descendente del renacuajo utilizando FACS. Barras de escala: 200 μm para embriones, 1,25 mm para el vial. Las figuras fueron adaptadas con permiso de las referencias 15,19,21,59. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El protocolo presentado aquí permite la cuantificación basada en HRMS de un gran número de proteínas en células / tejidos identificados en embriones de X. laevis en desarrollo. El enfoque se basa en la identificación precisa de células, mapas de destino celular reproducibles y metodologías establecidas para rastrear linajes celulares en este modelo biológico 6,7,8. Como se muestra en la Figura 1, estudiamos proteomas de células individuales empleando disección de células enteras o micromuestreo capilar para aspirar el contenido celular. El monitoreo del linaje de una célula nos permite estudiar la evolución espacio-temporal del proteoma a medida que las células forman tejidos durante la gastrulación. La progenie celular se marca fluorescentemente inyectando un fluoróforo conjugado con dextrano inerte o ARNm para la proteína fluorescente (por ejemplo, proteína fluorescente verde o GFP). La progenie etiquetada se aísla en los puntos de tiempo de desarrollo deseados. Durante la gastrulación, los clones celulares que están estrechamente agrupados pueden aislarse por disección. Después de la gastrulación, los clones celulares pueden distribuirse dentro del embrión debido a movimientos migratorios y pueden aislarse de tejidos disociados mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Las proteínas en estas células y tejidos se miden a través de la proteómica ascendente empleando HPLC o CE para la separación y ESI tándem HRMS para la identificación. La proteómica HRMS guiada por linaje celular es escalable a diferentes tamaños y linajes celulares dentro del embrión y es específica, sensible y cuantitativa. A través de ejemplos seleccionados que se muestran aquí, también demostramos que este protocolo es escalable y ampliamente adaptable a diferentes tipos de células y linajes celulares.

Figure 2
Figura 2: El flujo de trabajo bioanalítico. La microdisección y la aspiración capilar, o FACS, facilitaron el muestreo del contenido de proteínas celulares y clonales. Agotamiento de abundantes proteínas vitelinas y separación por electroforesis capilar (CE) o cromatografía líquida de nanoflujo (LC) mejora la sensibilidad de identificación (ID) utilizando espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) por ionización por electrospray (ESI). La cuantificación reveló desregulación, proporcionando nueva información para estudios basados en hipótesis junto con la información disponible de la ontología génica (GO). Las figuras fueron adaptadas con permiso de la referencia15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Todos los protocolos que garantizan el mantenimiento y manejo humanitario de las ranas adultas de Xenopus laevis fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Maryland, College Park (números de aprobación R-DEC-17-57 y R-FEB-21-07). 1. Preparar las soluciones Para embriologíaPreparar 1x, 0.5x y 0.2x solución de Steinberg (SS), luego autoclavelos (120 °C durante 20 min) para esterilidad siguiendo …

Representative Results

Este protocolo permitió el estudio de proteínas en células individuales y sus linajes a medida que establecen tejidos en embriones de X. laevis. La Figura 1 ilustra una de esas aplicaciones del enfoque para estudiar proteínas en células predestinadas al tejido neural y el ectodermo neural recién inducido en el embrión. Como se muestra en la Figura 1A, el flujo de trabajo bioanalítico integró herramientas tradicionales de biología celular y del…

Discussion

Este protocolo permite la caracterización de la expresión de proteínas en linajes celulares identificados en embriones de la especie Xenopus. Derivada de HRMS, la metodología combina una especificidad exquisita en la identificación molecular, la capacidad de detección de múltiples proteínas sin sondas moleculares (generalmente cientos a miles de proteínas diferentes) y la capacidad de cuantificación. La adaptabilidad a las herramientas y flujos de trabajo clásicos en biología celular y del desarrollo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Jie Li (Universidad de Maryland, College Park) por sus valiosos debates sobre la disociación embrionaria y el sistema de control de los bienes sobre el terreno. Agradecemos a Vi M. Quach y Camille Lombard-Banek por su ayuda con la preparación de muestras y la recopilación de datos en estudios previos que ejemplifican las aplicaciones proteómicas que se destacan en este protocolo. Partes de este trabajo fueron apoyadas por la National Science Foundation bajo el número de premio IOS-1832968 CAREER (a P.N.), los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio R35GM124755 (a P.N.), el Programa de Asociación de la Universidad de Maryland-Instituto Nacional del Cáncer (a P.N.) y los premios de investigación de la Fundación COSMOS Club (a A.B.B. y L.R.P.).

Materials

Acetonitrile (LC-MS-grade) Fisher Scientific A955
Agarose ThermoFisher Scientific R0492
Ammonium bicarbonate Fisher Scientific A643-500
Analytical Column Thermo Scientific 164941
Analytical microbalance Mettler-Toledo XSE105DU
Automatic peptide fractionation platform Agilent 1260 Infinity II
Borosilicate Capillaries Sutter Instruments Co. B100-50-10
Borosilicate Capillaries (for making Emmitters) Sutter Instruments B100-75-10
C18 spin columns (for desalting) ThermoFisher Scientific 89870
Camera ro monitor electrospray Edmund Optics Inc. EO-2018C
Combretastatin A4 Millipore Sigma C7744
Commercial CESI system AB SCIEX CESI
(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) VWR 97061-492
Cytochalasin D Millipore Sigma C8273
Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable ThermoFisher Scientific D22910
Diothiothreitol Fisher Scientific FERR0861
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-30
EDTA Fisher Scientific AAJ62786AP
Epifluorescence light source Lumencore AURA III
Eppendorf LoBing microcentrifuge  tubes: protein Fisher Scientific 13-698-793
Formic acid (LC-MS-grade) Fisher Scientific A117-50
Freezer (-20 °C) Fisher Scientific 97-926-1 
Freezer (-80 °C) Thermo Scientific TSX40086A
Fused silica capillary Molex 1088150596
Heat Block Benchmark BSH300
High pressure liquid Chromatography System ThermoFisher Scientific Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem
High voltage power supply Spellman CZE1000R
High-resolution Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer
HPLC caps Thermo Scientific C4013-40A
HPLC Vials Thermo Scientific C4013-11
Illuminator e.g. Goosenecks Nikon C-FLED2
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen
Iodoacetamide Fisher Scientific AC122275000
Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456
Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456-4
Microcapillary puller Suttor Instruments P-2000
Microinjector Warner Instrument, Handem, CT PLI-100A
Micropippette puller Sutter Instruments Co. P-1000
MS data analysis software, commercial ProteomeDiscoverer
MS data analysis software, opensource MaxQuant
non-idet 40 substitute Millipore Sigma 11754599001
Petri dish 60 mm and 80 mm Fisher Scientific S08184
Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting) ThermoFisher Scientific 87782
Pierce bicinchoninic acid protein assay kit ThermoFisher Scientific 23225
Pierce quantitative colorimetric peptide assay ThermoFisher Scientific 23275
Pierce Trypsin Protease (MS Grade) Fisher Scientific PI90058
Protein LoBind vials Eppendorf 0030108434
, 0030108442
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5430R
Refrigerated Incubator Thermo Scientific PR505755R/3721
sodium isethionate Millipore Sigma 220078
sodium pyrophosphate Sigma Aldrich 221368-100G
Stainless steel BGE vial Custom-Built
Stainless steel sample vials Custom-Built
Stereomicroscope (objective 10x) Nikon SMZ 1270, SZX18
Sucrose VWR 97063-790
Syringe pumps (2) Harvard Apparatus 704506
Syringes (gas-tight): 500–1000 µL Hamilton 1750TTL
Transfer pipettes (Plastic, disposable) Fisher Scientific 13-711-7M
Trap Column Thermo Scientific 164750
Tris-HCl (1 M solution) Fisher Scientific AAJ22638AP
Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C Labconco 7310022
Vortex-mixer Benchmark BS-VM-1000
Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
XYZ translation stage Thorlabs PT3
XYZ translation stage Custom-Built

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Cite This Article
Baxi, A. B., Pade, L. R., Nemes, P. Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo. J. Vis. Exp. (182), e63586, doi:10.3791/63586 (2022).

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