Summary
Den øgede grad af farmako- og toksikokinetiske analyser af metaller og metalbaserede forbindelser i zebrafisk kan være en fordel for miljømæssige og kliniske oversættelsesundersøgelser. Begrænsningen af ukendt vandbåren eksponeringsoptagelse blev overvundet ved at udføre spormetalanalyse på fordøjet zebrafiskvæv ved hjælp af induktivt koblet plasmamassespektrometri.
Abstract
Metaller og metalbaserede forbindelser omfatter mangfoldige farmakoaktive og toksikologiske xenobiotika. Fra tungmetaltoksicitet til kemoterapeutika har toksikokinetikken af disse forbindelser både historisk og moderne relevans. Zebrafisk er blevet en attraktiv modelorganisme til at belyse farmako- og toksikokinetik i miljøeksponering og kliniske oversættelsesundersøgelser. Selvom zebrafiskestudier har den fordel, at de har højere gennemstrømning end gnavermodeller, er der flere væsentlige begrænsninger for modellen.
En sådan begrænsning er iboende i det vandbårne doseringsregime. Vandkoncentrationer fra disse undersøgelser kan ikke ekstrapoleres for at give pålidelige interne doser. Direkte målinger af de metalbaserede forbindelser giver mulighed for en bedre korrelation med forbindelsesrelaterede molekylære og biologiske reaktioner. For at overvinde denne begrænsning for metaller og metalbaserede forbindelser blev der udviklet en teknik til at fordøje zebrafisk larvevæv efter eksponering og kvantificere metalkoncentrationer i vævsprøver ved induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICPMS).
ICPMS-metoder blev anvendt til at bestemme metalkoncentrationerne af platin (Pt) fra cisplatin og ruthenium (Ru) fra flere nye Ru-baserede kemoterapeutika i zebrafiskvæv. Derudover skelnede denne protokol koncentrationer af Pt, der blev sekvestreret i larvens korion sammenlignet med zebrafiskvævet. Disse resultater indikerer, at denne metode kan anvendes til at kvantificere den metaldosis, der er til stede i larvevæv. Endvidere kan denne metode justeres for at identificere specifikke metaller eller metalbaserede forbindelser i en bred vifte af eksponerings- og doseringsundersøgelser.
Introduction
Metaller og metalbaserede forbindelser har fortsat farmakologisk og toksikologisk relevans. Forekomsten af tungmetaleksponering og dens indvirkning på sundheden har eksponentielt øget den videnskabelige undersøgelse siden 1960'erne og nåede et all-time high i 2021. Koncentrationerne af tungmetaller i drikkevand, luftforurening og erhvervsmæssig eksponering overstiger lovgivningsmæssige grænser over hele verden og er fortsat et problem for arsen, cadmium, kviksølv, krom, bly og andre metaller. Nye metoder til at kvantificere miljøeksponering og analysere patologisk udvikling er fortsat i høj efterspørgsel 1,2,3.
Omvendt har det medicinske område udnyttet de fysiokemiske egenskaber af forskellige metaller til klinisk behandling. Metalbaserede lægemidler eller metallodrugs har en rig historie med medicinske formål og har vist aktivitet mod en række sygdomme, med den højeste succes som kemoterapeutika4. Den mest berømte af metallodrugs, cisplatin, er et Pt-baseret anticancerlægemiddel, der af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) anses for at være et af verdens essentielle lægemidler5. I 2010 havde cisplatin og dets Pt-derivater op til en succesrate på 90% i flere kræftformer og blev anvendt i ca. 50% af kemoterapiregimerne 6,7,8. Selvom Pt-baserede kemoterapeutika har haft ubestridelig succes, har den dosisbegrænsende toksicitet sat gang i undersøgelser af alternative metalbaserede lægemidler med raffineret biologisk levering og aktivitet. Af disse alternativer er Ru-baserede forbindelser blevet de mest populære 9,10,11,12.
Der er behov for nye modeller og metoder for at holde trit med behovet for farmako- og toksikokinetiske metalundersøgelser. Zebrafiskmodellen ligger i krydsfeltet mellem kompleksitet og gennemstrømning, idet den er et hvirveldyr med høj fecundity med 70% bevaret genhomologi13. Denne model har været et aktiv inden for farmakologi og toksikologi med omfattende screeninger for forskellige forbindelser til blyopdagelse, målidentifikation og mekanistisk aktivitet 14,15,16,17. Imidlertid er screening af kemikalier med høj kapacitet typisk afhængig af vandbårne eksponeringer. I betragtning af at optagelsen kan variere baseret på de fysisk-kemiske egenskaber af forbindelsen i opløsning (dvs. fotonedbrydning, opløselighed), kan dette være en væsentlig begrænsning af korrelerende dosislevering og respons.
For at overvinde denne begrænsning til sammenligning af dosis med højere hvirveldyr blev en metode designet til at analysere spormetalkoncentrationer i zebrafisk larvevæv. Her blev dosis-responskurver for dødelige og subletale endepunkter evalueret for cisplatin og nye Ru-baserede anticancerforbindelser. Dødelighed og forsinket udklækning blev evalueret for nominelle koncentrationer på 0, 3,75, 7,5, 15, 30 og 60 mg/l cisplatin. Pt-akkumulering i organismevæv blev bestemt ved ICPMS-analyse, og organismens optagelse af respektive doser var 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 og 461,9 ng (Pt) pr. organisme. Derudover blev zebrafisklarver udsat for 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg/l PMC79. Disse koncentrationer blev analytisk bestemt til at indeholde 0, 0,17, 0,44, 0,66 og 0,76 mg/l Ru. Denne protokol gjorde det også muligt at skelne mellem koncentrationer af Pt sekvestreret i larvernes kor sammenlignet med zebrafiskvævet. Denne metode var i stand til at tilvejebringe pålidelige, robuste data til sammenligninger af farmako- og toksikokinetisk aktivitet mellem en veletableret kemoterapeutisk og en ny forbindelse. Denne metode kan anvendes på en bred vifte af metaller og metalbaserede forbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
AB-stammen zebrafisk (Danio rerio) blev brugt til alle forsøg (se materialetabellen), og opdrætsprotokollen (# 08-025) blev godkendt af Rutgers University Animal Care and Facilities Committee.
1. Zebrafisk husdyrhold
- Opdræt og vedligehold zebrafisken i et recirkulerende akvatisk habitatsystem på en 14 timers lys: 10 timers mørk cyklus.
- Rens kommunalt ledningsvand gennem sand og kulfiltrering for at opnå fiskesystemvand. Vand i vandsystemet ved 28 °C, < 0,05 ppm nitrit, <0,2 ppm ammoniak og pH mellem 7,2 og 7,7.
- Foder zebrafisken en kost af klækkede Artemia cyster, saltlage rejer og fisk kost flager mad.
2. Zebrafisk dosis-respons protokol (figur 1)
- Der fremstilles zebrafisk ægvandsopløsning, enten E3-medium eller ægvand fremstillet af havsalt i en koncentration på 60 μg/ml opløst i deioniseret vand18. Undgå brug af methylenblåt.
BEMÆRK: Gennem ICPMS blev isobarisk interferens af zebrafiskægvand identificeret for strontiumoxider, som overlappede med en isotop af ruthenium. Omhyggelig skylning af larverne før downstream-analyse afhjælpede dette problem. E3-medium kan være et lettere valg for nogle på grund af den proprietære sammensætning af kommercielle havsalte. - Opløs metal- eller metalbaserede forbindelser i E3 eller æggevand. Vortex til at bryde ethvert aggregeret materiale op og homogenisere opløsningen.
BEMÆRK: I nedenstående forsøg blev PMC79 og cisplatin opløst i maksimale koncentrationer på 12,4 mg/l og 60 mg/l med en maksimal koncentration på 0,5 % dimethylsulfoxid (DMSO) for at modstå udfældning.- Fortynd tungmetal- eller metalbaserede forbindelser, såsom PMC79 og cisplatin, med E3 eller ægvand, og forbered mindst 5 koncentrationsdoser.
- Begynd med lave koncentrationer af stamopløsninger i rent køretøj (dvs. DMSO), fortynd derefter med E3 eller ægvand. Overvej de endelige køretøjskoncentrationer nøje.
BEMÆRK: Visse metalbaserede forbindelser, såsom cisplatin, nedbrydes hurtigt, og deres opløsninger skal gøres friske dagligt. FORSIGTIG: Håndter tungmetaller og kemoterapeutika med omhu. Gennemgå det specifikke materialesikkerhedsdatablad (MSDS) for det metal, der er af interesse. Cisplatin kan forårsage øjen- og hudirritation, være dødelig ved indtagelse og kan forårsage toksicitet i nyrer, blod, bloddannende organer og fostervæv. Undgå at indånde dampe og kontakt med øjne, hud og tøj. Brug uigennemtrængelige handsker og tøj samt sikkerhedsbriller eller beskyttelsesbriller19.
- Begynd med lave koncentrationer af stamopløsninger i rent køretøj (dvs. DMSO), fortynd derefter med E3 eller ægvand. Overvej de endelige køretøjskoncentrationer nøje.
- Fortynd tungmetal- eller metalbaserede forbindelser, såsom PMC79 og cisplatin, med E3 eller ægvand, og forbered mindst 5 koncentrationsdoser.
- Opsæt avlstanke eftermiddagen før forsøget i det ideelle forhold mellem 2 hunner og 1 han med en skillevæg på plads mellem kønnene20.
- Træk i skillevæggen, når lysene tændes til morgencyklussen.
- Lad zebrafisken yngle.
BEMÆRK: Avlstiden afhænger af den indledende eksponeringsfase, der kræves. I 3 timer efter frugtning tillades avl i ca. 2 timer. Æggene når 3 hpf efter rengøring og adskillelse af æg. - Flyt avlsfisken til en ren tank.
- Saml æggene ved at hælde tankvandet gennem en sil.
- Omvendt silen over en petriskål og brug en sprøjteflaske fyldt med E3 eller æggevand til at skylle æggene i fadet.
- Rengør fadet for mad og affald inden eksperimentel brug.
- Randomiser ca. tyve 3 hpf embryoner pr. dosis i individuelle glashætteglas ved hjælp af en overførselspipette og en lille mængde vand.
- Når alle embryoner er i hætteglas, skal du fjerne alt ægvand og udskifte med tilstrækkelig doseringsopløsning, så der er ca. 1 tomme opløsning over æggets højde.
BEMÆRK: Nødvendigheden af dechorionation bør overvejes nøje. Se diskussionsafsnittet for at få flere oplysninger. - Overhold embryonerne dagligt for læsioner eller dødelighed. På grund af den hurtige udvikling af embryonale zebrafisk skal du få daglige billeder ved hjælp af ethvert lysfeltmikroskop / kameraopsætning for at identificere mindre læsioner mellem dage.
- Ved afslutningen af dosisresponsen (4-5 dage efter befrugtning [dpf], i henhold til Organisationens økonomiske samarbejde og udvikling [OECD] retningslinje21), kombineres 3-5 larver inden aflivning til sammensat prøveudtagning. Aflives ved hurtig afkøling ved snapfrysning i flydende nitrogen.
BEMÆRK: Eutanasi gennem en overdosis AF MS-222 eller tricainmetansulfonat kan potentielt forstyrre ICPMS-analysen nedstrøms. Der tilskyndes til metoder til hurtig afkøling af aktiv dødshjælp, så denne protokol reducerer muligheden for interferens. - Udfør 3 vasker af væv med vand med høj renhed (såsom omvendt osmose) for at fjerne overskydende forbindelse fra vævets yderside.
- Flyt prøverne til syre- og mikrobølgesikre 15 ml polypropylencentrifugerør. Vær forsigtig med at fjerne alt overskydende vand , da enhver resterende væske kan fortynde salpetersyren og derfor syrens oxidationspotentiale under vævsnedbrydning.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan væv opbevares ved -20 °C indtil yderligere analyse. For naturligt rigelige metaller vil rengøring af rørene i et 5% salpetersyrebad inden brug forbedre de omgivende baggrundsniveauer.
3. Vævsfordøjelse og ICPMS-evaluering (figur 2)
- Tilsæt ca. 0,25 ml til 15 ml polypropylencentrifugerørene for op til 10 larver (~ 100 μg) salpetersyre med høj renhed (69%). Ultralydsat i 1 time for at forfordøje prøverne ved hjælp af følgende indstillinger: ultralydsbadudgang: 85 W; 42 kHz ± 6%; temperaturområde: 19-27 °C.
FORSIGTIG: Brug ørebeskyttelse under sonikering. Salpetersyre forårsager alvorlige luftvejs-, øjen- og hudforbrændinger. Brug fuldt beskyttelsesudstyr og arbejd i stinkhætten eller på steder med tilstrækkelig ventilation. Det kan være brandfarligt med andre materialer. Salpetersyre bør udelukkende håndteres i en stinkhætte for at forhindre udsættelse for dampe produceret under fordøjelsen. Må ikke indåndes eller indtages.- Udfør korte cyklusser af vævsfordøjelse (5 minutters intervaller) i en syresikker mikrobølgereaktor, indtil alt væv er synligt oxideret (dvs. ensartet, klar gul opløsning).
BEMÆRK: Mikrobølgeprotokollen i tabel 1 anbefales at udføres tre gange og inkluderer et 5 minutters afkølingsinterval mellem hvert opvarmningstrin. - Overvåg rørets integritet omhyggeligt for at undgå brud og udfør korte spins i centrifugen (313 × g i 1 min) mellem cyklusser for at flytte syrekondens til bunden af røret.
BEMÆRK: Hvis vævet er svært at fordøje (især chorioner), kan 30% hydrogenperoxid med høj renhed anvendes efter syrefordøjelsen. Brug hydrogenperoxidet (6,75 ml) til at fortynde syrekoncentrationen til 3,5%, og lad prøverne sidde natten over i en stinkhætte. Hydrogenperoxid nedbrydes tilH20og er egnet til ICPMS-analyse. Endvidere kan alternative metaller opløses bedre i saltsyre eller en blanding af saltsyre og salpetersyre (dvs. aqua regia). Hydrogenperoxid er skadeligt ved indtagelse og forårsager alvorlig øjenskade. Brug hud- og øjenbeskyttelse22,23.
- Udfør korte cyklusser af vævsfordøjelse (5 minutters intervaller) i en syresikker mikrobølgereaktor, indtil alt væv er synligt oxideret (dvs. ensartet, klar gul opløsning).
- Når vævet er synligt oxideret (dvs. ensartet, klar gul opløsning), fortyndes prøverne i en stinkhætte til 3,5% salpetersyre ved hjælp af 6,75 ml vand og hvirvel med høj renhed for at blande grundigt.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan prøverne opbevares ved stuetemperatur. Dette trin er unødvendigt, hvis hydrogenperoxid blev tilsat for at hjælpe fordøjelsen i trin 3.1. - Udfør en matrixmatchet 7-punkts kalibreringskurve (koncentrationsområde på 0,001-10 ppb) ved hjælp af en certificeret elementær standard (dvs. Pt eller Ru, afhængigt af assayet) med det metal, der er af interesse, og optimale isotoper for at tage højde for eventuelle isobariske interferenser.
- Ved hjælp af en lagerkoncentration af den vandige, certificerede elementære standard (Ru, Pt = 1000 ppb) tages en 0,1 ml alikvot og pipet i et nyt 15 ml centrifugerør. Fortynd med 3,5% salpetersyre til et endeligt volumen på 10 ml for at fremstille en 10 ppb standardopløsning.
- Brug 10 ppb-bestanden til at foretage følgende serielle fortyndinger: 0,1, 1,0 og 5,0 ppb standardopløsninger i 3,5% salpetersyre.
- Brug 0,1-bestanden til at foretage følgende serielle fortyndinger: 0,001, 0,005 og 0,01 ppb standardopløsninger i 3,5% salpetersyre.
- Forberede ICPMS-instrumentet (se Tabel over materialer) til prøveanalyse som følger:
- Før du starter instrumentet, skal du sørge for, at Argon-gasventilen er åben, at alle slanger er sikkert forbundet, og at ren 5% salpetersyre er åben til skylning af slanger og glasvarer mellem prøveanalyserne.
- Kontroller tilstanden af faklen og keglerne, og sørg for, at fakkelkassen er sikkert låst, og at sprøjtekammerets drænrør er korrekt forbundet med peripumpen.
- Åbn softwaren (se materialetabellen).
- Kontroller vakuumaflæsningerne, og sørg for, at alle turbopumper kører 100%.
- Klik på START i vinduet Status for plasmakontrolsystem for at starte startsekvensen, tænde plasmapumpen, plasmakøleren, rense forstøveren og tænde plasmaet. Vent på, at plasmaet lyser og er stabilt, når statusvinduet angiver, at startsekvensen er afsluttet. På dette tidspunkt skal du observere de grønne prikker i vinduet Systemtilstand , der angiver, at alle strømforsyninger er tændt.
- Klik på Control | autosampler i rullemenuen på menulinjen. Indtast autosamplerstativets position for røret, der indeholder 5% salpetersyre. Lad syren komme ind i plasmaet.
- Klik på Scanninger | Magnet i rullemenuen. Skriv 115 i vinduet MagnetScan i markørens masseposition, og klik på enter. Lad magneten scanne på tværs af masseområdet i 115In (114.6083 til 115.3749) i 30 minutter, mens instrumentet varmer op.
- Efter 30 minutter skal du bruge autosampler-kontrolelementet til at flytte til positionen for en 1 ppb multielementindstillingsløsning. Aspirer tuningløsningen, og indstil instrumentet for at optimere signalaflæsningen. Juster fakkelpositionen (X, Y, Z), således at faklen er justeret med midten af keglerne og forstøverstrømningshastigheden (~ 30 psi) i Plasma-kontrolvinduet . Foretag de nødvendige justeringer i vinduet Ion Optics Tuning for Source, Detector og Analyzer.
- Når signalaflæsningen er optimeret (~1,2 × 106 tællinger/s for 1 ppb på 115In), skal du klikke på Stop i vinduet Magnetscanning .
- Klik på Kalibrer magnet, og vælg Lav opløsning i pop op-vinduet.
- Klik på OK , og åbn filen "Massekalibrering (lav opløsning).smc" for at kalibrere magneten.
BEMÆRK: Magnetkalibreringen måler antallet/tallet og passer til en kurve gennem følgende masseområde: 7Li til 238U. - Klik på Gem | Bruges til at anvende den aktuelle magnetkalibrering på analyserne. Hvis du måler ukendte prøver med et stort udvalg af koncentrationer, skal du udføre en detektorkalibrering for at sammenligne ionpulstællingssignaler ved lave koncentrationer med dæmpede ionsignaler produceret ved højere koncentrationer. Analyser prøverne, når tuning og kalibrering er afsluttet.
- Klik på Dataindsamling på menulinjen.
- Klik på Metodeopsætning i rullemenuen. Brug en eksisterende metode fra producenten, eller opret en metode baseret på de elementer, der er af interesse. Juster om nødvendigt analysetilstanden, opholdstiden, switchforsinkelsen, antallet af fejninger/cyklusser, opløsning, detektionstilstand og parkmassen for deflektorindstillinger.
- Klik på Gem for at registrere metodeindstillingerne. Optimer parametrene for hvert metal og isotop. Se tabel 2 for de specifikke driftsparametre, der er anvendt i denne undersøgelse.
- Klik på Dataindsamling på menulinjen.
- Klik på Batch Run i rullemenuen. Alternativt kan du klikke på BATCH-ikonet under menulinjen. Importer batchparametrene fra et regneark, eller opret en sekvens i vinduet Batchkørsel . Angiv eksempeltypen, autosamplerstativets position, overførselstiden, vasketiden, replikater, prøve-id og metodefil.
- Arranger batchkørslen i følgende rækkefølge: standardløsninger til kalibreringskurven (0,001-10 ppb Pt eller Ru) efterfulgt af en kvalitetskontrolstandard og derefter ukendte prøver.
BEMÆRK: Standardløsninger måles som antal/s på ICPMS, og en lineær regression passer gennem standarderne med en relativ standardafvigelse (RSD) > 0,999. Ukendte måles også som tællinger/s og løses for koncentration i ppb ved hjælp af kalibreringskurvens lineære regression, y = mx + b. Databehandling kan også afsluttes ved hjælp af den refererede software. - Overvåg instrumentdrift og prøvereproducerbarhed ved at inkludere en kvalitetskontrolstandard på 0,5 ppb hver 5-10 prøver.
BEMÆRK: Egnede kvalitetskontrolstandarder bør være et certificeret standardreferencemateriale, der adskiller sig fra den standard, der anvendes i kalibreringskurven.
| Watt | Magt | Minutter |
| 300 | 50% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
| 300 | 0% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
Tabel 1: Mikrobølgefordøjelsesprotokol for larvevævsmasse. Zebrafisk larveprøver blev fordøjet i 0,25 ml salpetersyre. Denne tabel er blevet ændret fra 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse resultater er tidligere offentliggjort24. Vævsoptagelsesundersøgelser blev udført med vandbårne eksponeringer af cisplatin og en ny Ru-baseret anticancerforbindelse, PMC79. Dødelighed og forsinket udklækning blev evalueret for nominelle koncentrationer af cisplatin 0, 3,75, 7,5, 15, 30 og 60 mg/l cisplatin. Pt-akkumulering i organismevæv blev bestemt ved ICPMS-analyse, og organismevæv indeholdt respektive doser på 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 og 461,9 ng (Pt) pr. organisme (figur 3). Analytisk bestemmelse af de nominelle koncentrationer for cisplatin blev ikke vurderet på grund af cisplatins kendte stabilitet.
Forsinket udklækning blev observeret ved alle cisplatinkoncentrationer. Yderligere eksperimenter blev udført for Pt-koncentrationer med og uden manuel dechorionation. Efter dechorionation blev chorioner indsamlet og analyseret for Pt separat. Ikke-dødelige doser cisplatin anvendt til dechorionationsundersøgelser fastslog, at 93-96 % af den samlede leverede dosis cisplatin var akkumuleret i korionen med den resterende dosis i larvevævet (figur 4).
Zebrafisklarver blev udsat for 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg/l PMC79. Disse doser blev udvalgt ved at bestemme derivaterne af en IC50, som beskrevet tidligere16. Disse koncentrationer blev analytisk bestemt til at indeholde 0, 0,17, 0,44, 0,66 og 0,76 mg/l Ru. I modsætning til cisplatin dosis-respons kurven blev forsinket udklækning ikke observeret i PMC79-eksponerede larver. Chorioner blev ikke inkluderet i Ruthenium-analysen, da de naturligt nedbrydes før larveindsamling. Forskere kan inkludere chorionanalyse uden forsinket udklækning ved at dekrinere og indsamle chorioner ved 24 dpf. Massen af metal i larvevæv analyseret ved hver koncentration var 0,19, 0,41 og 0,68 ng (Ru) pr. Larve (figur 5). Tabel 3 findes et resumé af de toksikologiske endpoints, herunder dødelige koncentrationer og/eller doser for50 % af befolkningen (LC50/LD 50), effektive koncentrationer eller doser for 50 % af populationerne (EC50/ED50) og det laveste niveau for observerede negative virkninger (LOAEL).
| Cisplatin | 4000-tiden | |||||
| Nominel (mg/L) | μM | Pt (ng) / organisme | Analytisk Ru (mg/L) | μM | Ru (ng) / organisme | |
| LC50/LD50 | 31 (95% CI: 20,5-34,0) | 158 (95% CI: 105-174) | 193 (± 130) | 0,79 (95% CI: 0,43-1,20) | 7,8 (95% CI: 4,2-11,8) | NA |
| EF50 | 4.6 | 12.5 | NA | NA | NA | NA |
| LOAEL | 3.75 | 15.3 | 8.7 (± 4) | 0.17 | 1.7 | 0.19 (± 0.05) |
Tabel 3: Bestemmelse af opløsning og metallodrugoptagelse i forbindelse med toksikologiske endepunkter. LD50 blev bestemt ved metalækvivalent analyse af Pt og Ru for henholdsvis cisplatin og PMC79. LC50-koncentrationerne for PMC79 blev analytisk bestemt. Analytisk bestemmelse af nominelle cisplatinkoncentrationer blev imidlertid ikke udført; I betragtning af den kendte stabilitet af cisplatin i opløsning blev det antaget, at nominelle og målte koncentrationer i opløsning ville være ækvivalente. Det forsinkede udklækningsendepunkt for cisplatineksponering blev evalueret i henhold til ED50 og LOAEL. LOAEL-koncentrationerne af PMC79 blev analytisk bestemt. LOAEL omfattede læsioner såsom blødning langs den kaudale vene og halearterie, spinal krumning og æggeblomme sac ødem. Alle 95% konfidensintervaller blev beregnet ved hjælp af Litchfield Wilcoxon-metoden. Denne tabel er blevet ændret fra 24. Forkortelser: CI = konfidensinterval; LC50 = Dødelig koncentration for 50% af befolkningen; LD50 = Dødelig dosis for 50% af befolkningen; EC50 = Effektiv koncentration for 50% af befolkningen; LOAEL = laveste observerede effektniveau.
Figur 1: Zebrafisk dosis-respons protokol. I denne protokol anvendes en modificeret tilgang, der er tilpasset OECD's FET. Lavet med Biorender. Forkortelse: OECD = Organisationens Økonomiske Samarbejde og Udvikling; FET = fiskeembryon akut toksicitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vævsfordøjelse og ICPMS-evaluering. Fordøjelsesprotokollen er effektiv til fordøjelse af en sammensat prøve af zebrafisklarver. Forkortelse: ICPMS = induktivt koblet plasmamassespektrometri. Oprettet med Biorender. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Cisplatin dosis-respons. (A) Procentdel gennemsnitlig forsinket udklækning ved 5 dpf korreleret med de gennemsnitlige Pt-ækvivalenter bestemt pr. organisme. B) Procentvis gennemsnitlig dødelighed ved 5 dpf korreleret med de gennemsnitlige Pt-ækvivalenter pr. organisme. Procentdel betyder: N = 40 pr. Dosis. Pt (ng) pr. organisme: >4 sammensatte prøver pr. dosis. To eksperimentelle replikater blev udført, hvis intervaller vises. Dette tal er ændret fra 24. Forkortelse: dpf = dage efter befrugtning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Sammenligning af Pt (ng) til stede i larverne og korionen efter eksponering for 7,5 eller 15 mg /l. Sammensatte >3 larver eller korioner pr. prøve; fra venstre mod højre N = 13, 10, 10 og 11. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelse. Mann-Whitney rang-sum test P < 0,001 mellem larver og chorion for begge doser. Dette tal er ændret fra 24. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: PMC79-dosisrespons. (A) Procentvis gennemsnitlig dødelighed var korreleret med de analytisk bestemte gennemsnitlige Ru-ækvivalenter i opløsning (mg/l). (B) Procentvis gennemsnitlig dødelighed 5 dage efter befrugtning fra samme forsøg var korreleret med de gennemsnitlige Ru-ækvivalenter pr. larve. Dødelighed: N = 40 pr. Dosis. Ru (mg/l): N = 6 sammensatte prøver pr. dosis. Ru (ng) pr. larve >4 sammensatte prøver pr. dosis. To eksperimentelle replikater blev udført, hvis intervaller vises. Dette tal er ændret fra 24. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Opholdstid pr. Spidsbelastning | 4 ms |
| Switch Delay/ Peak (x10micros) | 2 |
| Antal fejninger | 350 |
| Antal cyklusser | 1 |
| Opløsning af instrument | 300 |
| Registreringstilstand | Dæmpet, deflektorspring |
| Parkmasse | 98.90594 |
| Element (isotoper) | Pt (192, 194, 195, 196), Ru (99, 100, 101, 102) Sr (84) |
Tabel 2: ICPMS-metodeparametre. Parametre til analyse af Pt- og Ru-isotoper til bestemmelse af vævskoncentrationer af henholdsvis cisplatin og PMC79. Sr blev inkluderet for at overvåge isobariske interferenser forbundet med tankvandssammensætningen. Denne tabel er blevet ændret fra 24. ICPMS = induktivt koblet plasmamassespektrometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her er blevet implementeret for at bestemme levering og optagelse af metalbaserede kræftlægemidler, der indeholder enten Pt eller Ru. Selv om disse metoder allerede er blevet offentliggjort, diskuterer denne protokol vigtige overvejelser og detaljer for at tilpasse denne metode til en række forbindelser. OECD-protokollen kombineret med vævsfordøjelse og ICPMS-analyse tillod os at bestemme, at PMC79 var mere potent end cisplatin og resulterede i forskellig vævsakkumulering, hvilket tyder på separate mekanismer. Da den leverede dosis cisplatin blev kvantificeret, blev dosis-respons-resultaterne desuden ekstrapoleret til patientpopulationer. Subletale doser (f.eks. LOAEL) var sammenlignelige med intravenøse doseringskoncentrationer hos patienter24.
Selv om denne metode kan anvendes på et bredt spektrum af metaller og metalbaserede forbindelser, skal der foretages en omhyggelig undersøgelse af analyttens fysisk-kemiske egenskaber. Metalbaserede forbindelser kan være meget vanskelige at opløse, og forskellige køretøjer kan bruges til at undgå dette. Køretøjskoncentrationer, såsom DMSO, skal muligvis være i højere koncentrationer end anbefalet i OECD-protokollen. Som sådan er det vigtigt at opretholde en ugiftig dosis ved nøje at overvåge udviklingen af kontroller; kontinuerligt at gynge embryonerne under eksponering mindsker nedbør. Derudover er organometalliske forbindelser muligvis ikke stabile i vandig opløsning. Hvis nedbrydningsprocessen er ukendt, kan undersøgelser, der involverer fornyelse af 24 timers opløsning, overvejes eller sammenlignes med dosis-responskurver for ikke-fornyelse.
Det anbefales at følge OECD's Fish Acute Embryo Toxicity Test (FET) nummer 23621. Ændringer kan dog foretages, så de passer til specifikke formål. Glasbeholdere undgår at forvirre toksikologiske variabler, såsom plast og blødgørere, og adsorberer ikke metaller så stærkt, hvilket ville fjerne analytter fra ægvandet. For forbindelser, der fotonedbrydes, såsom cisplatin, kan det være gavnligt at udføre eksponeringen uden en lyscyklus.
Der er meget diskussion i litteraturen om behovet for dechorionation i zebrafisk dosis-respons undersøgelser 25,26,27. Argumenter for dechorionation ved 24 hpf tyder på, at korionen begrænser permeabiliteten af forbindelser og dermed genererer falsk-negative resultater eller forstørrede dosis-responskurver. Selvom disse punkter har fortjeneste, kan gennemførelse af undersøgelser uden dechorionation give mekanistisk indsigt. Disse undersøgelser tyder på, at cisplatin akkumuleres i embryonernes chorion på grund af dets alkylerende aktivitet (figur 2). De resulterende addukter forstærker strukturen, hvilket resulterer i forsinket udklækning. PMC79 og andre Ru-baserede kræftlægemidler forårsagede imidlertid ikke dette fænomen27. Selvom mange kemoterapeutika vedtager deres anticanceraktivitet ved alkylering, indikerede manglen på forsinket udklækning efter PMC79-eksponering en uensartet mekanisme. Undersøgelser med eller uden dechorionation skal overvejes nøje eller udføres parallelt.
Nedstrøms vævsfordøjelse og ICPMS-analyse skal løbende overvejes. Det foreslås at undgå at bruge reagenser, der kan forårsage isobariske interferenser og implementere alternative metoder. Reagenser, der anvendes under dosis-respons-undersøgelserne, kan påvirke eller reagere med salpetersyren og dens oxidationspotentiale eller bidrage til isobariske interferenser. Det blev opdaget, at saltopløsningen, der blev brugt til at fremstille ægvand, genererede strontium (Sr) oxider, som overlappede med en specifik isotop af Ru24. Sænkning af saltkoncentrationer eller omhyggelig rengøring af larverne kan afhjælpe dette problem. Af disse grunde foreslås det at undgå det antimikrobielle methylenblåt eller det aflivende middel, tricain. I stedet autoklave og efterfølgende lufte æggevandet for at fjerne mikrober eller aflive larverne ved hurtig afkøling. Det er vigtigt på dette trin at opnå lineære isotopiske standardkurver med minimale isobariske interferenser for den analyt, der er af interesse.
En vigtig begrænsning for denne protokol er, at organometalliske forbindelser oxideres, således at kun metallet er tilbage. Som sådan kan metabolismeundersøgelser ikke udføres. Selvom protokollen kan betragtes som medium gennemstrømning, kan dosis-respons-delen fremskyndes ved hjælp af automatiske kemiske leveringssystemer og billeddannelse. Denne protokol er en spirende metode, der kan modificeres og raffineres til et bredt spektrum af metal- og metalbaserede forbindelser til farmako- og toksikokinetiske undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen interessekonflikter, der skal oplyses af nogen af forfatterne.
Acknowledgments
Finansiering: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Derudover støttes Brittany Karas af uddannelsestilskud T32NS115700 fra NINDS, NIH. Forfatterne anerkender Andreia Valente og det portugisiske fundament for videnskab og teknologi (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) til levering af PMC79.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
References
- Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
- Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65 (2018).
- Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821 (2021).
- Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
- Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
- Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B.
- Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925 (2019).
- Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
- Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995 (2019).
- Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G.
- Lin, K., Zhao, Z. -Z., Bo, H. -B., Hao, X. -J., Wang, J. -Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Pfizer. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer. , Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013).
- EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
- Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298 (2014).
- Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656 (2020).
