Mapas micorrízicos como ferramenta para explorar padrões de colonização e estratégias fúngicas nas raízes de Festuca rubra e zea mays
Summary
O protocolo aqui descreve os métodos para a avaliação dos padrões de colonização micorrízica arbuscular e a estratégia em raízes para duas espécies: Zea mays e Festuca rubra. O uso do método MycoPatt permite o cálculo de parâmetros, a conversão de estruturas micorrízicas em dados digitais e o mapeamento de sua posição real nas raízes.
Abstract
Os fungos micorrízicos arbusculares são simbiontes nas raízes das plantas. Seu papel é sustentar o desenvolvimento do hospedeiro e manter o equilíbrio nutricional nos ecossistemas. O processo de colonização é dependente de vários fatores, como a ecologia do solo, a diversidade genética dos fungos e hospedeiros e práticas agronômicas. Sua ação sincronizada leva ao desenvolvimento de uma complexa rede hifal e leva ao desenvolvimento secundário de vesículas e arbúsculos nas células radiculares. O objetivo deste trabalho foi analisar a eficiência do método de padrões micorrízicos (MycoPatt) para o posicionamento de estruturas fúngicas nas raízes de Festuca rubra e Zea mays. Outro objetivo foi explorar a estratégia de colonização fúngica revelada pelos mapas micorrízicos de cada espécie. A aquisição e a montagem de múltiplas imagens microscópicas permitem a avaliação da colonização micorrízica em plantas de milho e fescue vermelha para fornecer informações sobre a posição realista das estruturas desenvolvidas. Os padrões micorrízicos observados destacam a eficiência variável de cada planta em termos de desenvolvimento de conexões com fungos simbióticos do solo, causadas por tratamentos aplicados e estágio de crescimento. Mapas detalhados micorrízicos obtidos pelo método MycoPatt são úteis para a detecção precoce da eficiência das plantas na aquisição simbiótica do solo.
Introduction
Os fungos micorrizas arbusculares (MA) são uma categoria de endófitos transmitidos pelo solo que são constantemente uma área de interesse para os pesquisadores. Sua presença nas raízes da maioria das plantas e seu envolvimento nos ciclos de nutrientes as tornam componentes vitais na estabilidade de todos os ecossistemas onde as plantas herbáceas estão presentes 1,2. Através de seu micélio extra-radicular, o AM atua como uma extensão fúngica para as raízes das plantas, especialmente em áreas de difícil acesso3. A principal atividade é nas raízes das plantas hospedeiras, onde a MA desenvolve grandes redes de hifas e estruturas intracelulares específicas chamadas arbúsculos. A falta de especificidade do hospedeiro permite que o simbionte colonize várias espécies ao mesmo tempo. Essa habilidade fornece à AM o papel da alocação de recursos e da regulação de nutrientes no ecossistema; o fungo também fornece suporte na sobrevivência das plantas e auxilia no desempenho das plantas 4,5,6,7. A reação de espécies de micorrizas arbustivas às raízes hospedeiras é visível na extensão e localização do micélio intra-radicular e na presença e forma dos arbúsculos desenvolvidos intracelularmente. Os arbúsculos intracelulares atuam como um ponto de intercâmbio entre os dois simbiontes e representam áreas caracterizadas por processos de transferência rápida. As estruturas que o AM produz são dependentes da espécie e, além dos arbúsculos, nas raízes, eles também desenvolvem vesículas, esporos e células auxiliares.
Há muitos desafios na avaliação de simbiontes de micorrizas arbusculares em raízes de plantas 8,9. O primeiro deles é o seu constante desenvolvimento durante todo o período de vegetação dos hospedeiros, o que leva a múltiplas mudanças na estrutura arbuscular hifal. Os diferentes estágios do crescimento arbuscular, até o seu colapso, estão claramente presentes nas raízes, mas as estruturas arbusculares senescentes às vezes são digeridas, o que as torna apenas parcialmente visíveis10. O segundo desafio é representado pelo método e protocolo de coloração, pela grande diversidade de sistemas radiculares, pela dimensão de suas células e pelas diferenças de espessura, que dificultam a proposição de um método unificado. O último desafio é representado pela avaliação e pontuação da colonização da MA. Existem inúmeros métodos que pontuam a MA com diferentes graus de objetividade, e a maioria deles ainda está restrita às técnicas de microscopia. As simples baseiam-se na presença/ausência de estruturas no córtex radicular, enquanto as mais complexas baseiam-se no escore visual e no uso de classes de colonização, com a integração da frequência e intensidade do fenômeno de colonização. Muitos dados foram produzidos nas últimas décadas sobre o status micorrízico de múltiplas espécies, mas a maioria dos métodos se restringe ao valor observado da colonização sem apontar para a posição real de cada estrutura no córtex radicular. Como resposta à necessidade de resultados mais precisos sobre a colonização por MA, foi desenvolvido um método baseado na análise microscópica de padrões micorrízicos (MycoPatt) em raízes para montar, em formato digital, os mapas micorrízicos detalhados11. Além disso, o método permite o cálculo objetivo dos parâmetros de colonização e a determinação da posição real de cada estrutura na raiz.
A posição das estruturas fúngicas da micorrizas do miocárdio pode ser importante para responder às duas perguntas a seguir. A primeira está relacionada à análise da colonização em um momento específico do ciclo vegetacional de uma planta. Nesse contexto, é muito útil observar a abundância de arbusculares/vesículas, relatar como elas estão localizadas na raiz e fornecer uma imagem e parâmetros de colonização muito claros. A segunda está relacionada à detecção da estratégia fúngica e sua orientação e até mesmo à previsão de seu desenvolvimento futuro. Uma aplicação do MycoPatt pode ser para plantas analisadas diariamente, a cada 2-3 dias, semanalmente ou durante vários estágios de crescimento. Nesse contexto, a localização das vesículas/arbúsculos é importante para melhor compreensão do mecanismo biológico da colonização por MA. Estes parâmetros e observações são muito úteis para complementar os parâmetros matemáticos.
O objetivo deste artigo é demonstrar a capacidade do sistema MycoPatt de explorar o potencial e a estratégia de colonização de fungos de micorrizas arbusculares nativos em raízes de Zea mays (milho) durante diferentes estágios de desenvolvimento e em raízes de Festuca rubra (fescue vermelha) sob diferentes condições de fertilização a longo prazo. Para cumprir o objetivo, foram analisadas duas grandes bases de dados de dois experimentos. O experimento com milho foi estabelecido em Cojocna (46°44′56″ lat. N e 23°50′0″ de comprimento. E), na Fazenda Didática Experimental da Universidade de Ciências Agrárias e Medicina Veterinária de Cluj sobre um feozoima com textura argilosa do solo12. O experimento de fescue vermelha é uma parte de um local experimental maior estabelecido em 2001 em Ghețari, Montanhas Apuseni (46°49’064″ lat. N e 22°81’418” de comprimento. E), em um solo preluvosol (terra rossa) tipo13,14. O milho foi coletado em cinco diferentes fenófases de crescimento12: B1 = 2-4 folhas (como ponto de controle para o início da colonização micorrízica); B2 = 6 folhas; B3 = 8-10 folhas; B4 = formação de espiga ; B5 = maturidade fisiológica. A partir do estágio de 2-4 folhas (A0), aplicou-se um tratamento orgânico, que resultou em um fator de duas graduações (A1 = controle e A2 = tratado). Raízes de fescue vermelha foram coletadas na floração de um experimento com cinco adubações de longa duração13,14: V1 = controle, não adubado; V2 = 10 t·ha-1 de estrume; V3 = 10 t·ha-1 de estrume + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25 kg·ha-1, K2O 25 kg·ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1; V5 = 10 t·ha-1 de estrume + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1. Cinco plantas foram coletadas em cada estágio de desenvolvimento de cada variante de fertilização. Foram analisados os protocolos de coloração e seu desempenho em termos de tempo de processamento da amostra e qualidade da coloração. A relação entre o desenvolvimento das hifas de micorrizas arbustivas e a presença de suas estruturas nas raízes foi analisada separadamente para cada espécie e continuou com a identificação das raízes mais permissivas para colonização. Os padrões específicos de colonização de cada sistema radicular foram analisados com base em mapas de colonização e no valor dos parâmetros de MA.
O milho é uma planta anual, o que implica o crescimento contínuo das raízes, e essa foi a principal razão para aplicar o MycoPatt nos estágios de crescimento. A fescue vermelha é uma planta perene de uma pastagem tratada por um longo tempo com diferentes fertilizantes. Suas raízes têm um desenvolvimento mais curto de 1 ano, e a antese é considerada como o ponto de vegetação quando a planta muda seu metabolismo de vegetativo para generativo. Para a captura dessas plantas durante esses períodos de intensa atividade, foram escolhidos os pontos de tempo acima mencionados. A amostragem durante o período de vegetação é difícil para esta espécie quando cultivada em pastagens naturais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudos sobre colonização micorrízica são vitais para o desenvolvimento de novas estratégias no campo agronômico. O potencial de múltiplas plantas cultivadas para formar uma associação simbiótica com micorrizas arbusculares tornou-as um importante componente do desenvolvimento sustentável do agroecossistema e da manutenção de sua saúde 16,17,18,19,20.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este artigo utiliza dados resultantes de dois estudos de doutoramento na área temática de “Corn Mycorrhizal Patterns Driven by Agronomic Inputs”, conduzidos por Victoria Pop-Moldovan, e “Mycorrhizal Status and Development of Colonization in Mountain Grassland Dominant Species”, conduzido por Larisa Corcoz, sob a coordenação da Profª Dra. Roxana Vidican.
Materials
| Apple vinegar 5% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE MERE | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere |
| Blue Ink | Pelikan | 4001 | https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan |
| Cover slips | Menzel-Glaser | D 263 M | https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser |
| Forceps, PMP | Vitalab | 9.171 411 | http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33 |
| Glass jar 47 mL | Indigo Cards | BORCAN 47 ML HEXAGONAL | https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal |
| Laminating Pouches | Peach | PP525-08 | Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328 |
| Microflow Class II ABS Cabinet | Bioquell UK Ltd | Microflow Class II ABS Cabinet | http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf |
| Microscope slides | Deltalab | D100001 | https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26×76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE |
| Microsoft Office 365 | Microsoft | Office 365 | Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation |
| NaOH | Oltchim | 01-2119457892-27-0065 | http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf |
| Nitrile gloves | SemperGuard | 816780637 | https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE |
| Optika camera | OPTIKA | CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0 | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/ |
| Optika Microscope | OPTIKA | B383pL | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/ |
| Protective mask FFP3 | Hermes Gift | HERMES000100 | EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section |
| Scalpel | Cutfix | 9409814 | https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809 |
| White wine vinegar 9% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE VIN ALB | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb |
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