Микоризные карты как инструмент для изучения моделей колонизации и грибковых стратегий в корнях Festuca rubra и Zea mays
Summary
В протоколе здесь описываются методы оценки паттернов и стратегии арбускулярной микоризной колонизации в корнях для двух видов: Zea mays и Festuca rubra. Использование метода MycoPatt позволяет рассчитывать параметры, преобразовывать микоризные структуры в цифровые данные, отображать их реальное положение в корнях.
Abstract
Арбускулярные микоризные грибы являются симбионтами в корнях растений. Их роль заключается в поддержании развития хозяев и поддержании равновесия питания в экосистемах. Процесс колонизации зависит от нескольких факторов, таких как экология почвы, генетическое разнообразие грибов и хозяина, а также агрономические методы. Их синхронизированное действие приводит к развитию сложной гифальной сети и приводит к вторичному развитию везикул и арбускул в корневых клетках. Целью данного исследования был анализ эффективности метода микоризных паттернов (MycoPatt) для позиционирования грибковых структур в корнях Festuca rubra и Zea mays. Другая цель состояла в том, чтобы исследовать стратегию грибковой колонизации, выявленную микоризными картами каждого вида. Получение и сборка нескольких микроскопических изображений позволяют оценить микоризную колонизацию как кукурузы, так и красной овсяницы для получения информации о реалистичном положении развитых структур. Наблюдаемые микоризные паттерны подчеркивают переменную эффективность каждого растения с точки зрения развития связей с почвенными симбиотическими грибами, вызванных прикладными обработками и стадией роста. Микоризные подробные карты, полученные с помощью метода MycoPatt, полезны для раннего выявления эффективности растений при симбиотическом приобретении из почвы.
Introduction
Грибы arbuscular mycorrhiza (AM) представляют собой категорию почвенных эндофитов, которые постоянно представляют интерес для исследователей. Их присутствие в корнях большинства растений и их участие в циклах питательных веществ делает их жизненно важными компонентами в стабильности каждой экосистемы, где присутствуют травянистые растения 1,2. Благодаря своему внеколесковому мицелию AM действует как грибковое расширение для корней растений, особенно в труднодоступных районах3. Основная деятельность находится в корнях растений-хозяев, где AM развивает большие гифные сети и специфические внутриклеточные структуры, называемые арбускулами. Отсутствие специфичности хозяина позволяет симбионту колонизировать несколько видов одновременно. Эта способность обеспечивает АМ роль распределения ресурсов и регулирования питательных веществ в экосистеме; гриб также обеспечивает поддержку в выживании растений и помогает в производительности растений 4,5,6,7. Реакция видов AM на корни хозяина видна в расширении и расположении внутрикорешкового мицелия, а также в наличии и форме арбускул, развитых внутриклеточным образом. Внутриклеточные арбускулы действуют как обменная точка между двумя симбионтами и представляют собой области, характеризующиеся быстрыми процессами переноса. Структуры, которые производят АМ, зависят от вида, и, помимо арбускул, в корнях они также развивают везикулы, споры и вспомогательные клетки.
Существует много проблем в оценке AM симбионтов в корнях растений 8,9. Первый – это их постоянное развитие в течение всего вегетационного периода хозяев, что приводит к множественным изменениям в гифальной арбускулярной структуре. Различные стадии роста арбускулярных соединений, вплоть до их коллапса, явно присутствуют в корнях, но стареющие структуры AM иногда перевариваются, что делает ихвидимыми лишь частично 10. Вторая проблема представлена методом и протоколом окрашивания, большим разнообразием корневых систем, размерами их клеток и различиями в толщине, которые затрудняют предложение единого метода. Последняя задача заключается в оценке и оценке колонизации АМ. Существует множество методов, которые оценивают АМ с разной степенью объективности, и большинство из них по-прежнему ограничены методами микроскопии. Простые основаны на наличии/отсутствии структур в корневой коре, в то время как более сложные основаны на визуальной оценке и использовании классов колонизации, с интеграцией частоты и интенсивности феномена колонизации. За последние десятилетия было получено много данных о микоризном статусе нескольких видов, но большинство методов ограничены наблюдаемой ценностью колонизации, не указывая на реальное положение каждой структуры в корневой коре. В ответ на необходимость получения более точных результатов по колонизации АМ был разработан метод, основанный на микроскопическом анализе микоризных паттернов (MycoPatt) в корнях для сборки в цифровом виде подробных микоризных карт11. Также метод позволяет объективно рассчитать параметры колонизации и определить фактическое положение каждой структуры в корне.
Положение грибковых структур AM может быть важным в ответе на следующие два вопроса. Первый связан с анализом колонизации в один конкретный момент из вегетационного цикла растения. В этом контексте очень полезно наблюдать за обилием арбускулярных/пузырьков, сообщать, как они расположены в корне, и обеспечивать очень четкое изображение и параметры колонизации. Второй связан с выявлением грибковой стратегии и ее направленностью и даже прогнозом ее дальнейшего развития. Одно применение MycoPatt может быть для растений, анализируемых ежедневно, каждые 2-3 дня, еженедельно или во время различных стадий роста. В этом контексте расположение везикул / арбускул важно для лучшего понимания биологического механизма колонизации AM. Эти параметры и наблюдения очень полезны для дополнения математических параметров.
Целью данной статьи является демонстрация способности системы MycoPatt исследовать потенциал и стратегию колонизации нативных грибов AM в корнях Zea mays (кукуруза) на разных стадиях развития и в корнях Festuca rubra (красная овсяница) при различных долгосрочных условиях оплодотворения. Для выполнения поставленной цели были проанализированы две большие базы данных из двух экспериментов. Эксперимент с кукурузой был установлен в Кожокне (46°44′56″ широты и 23°50′0″ длиной. E), в Экспериментальной дидактической ферме Университета сельскохозяйственных наук и ветеринарной медицины Клуж на феозиом с суглинистой текстуройпочвы 12. Эксперимент с красной овсяницей является частью более крупного экспериментального участка, созданного в 2001 году в Гецари, горы Апусени (46°49’064″ широты n и 22°81’418” длиной. Е), на прелювосоле (terra rossa) почвы типа 13,14. Кукурузу собирали в пять различных фенофаз роста12: В1 = 2-4 листа (в качестве контрольной точки для начала микоризной колонизации); B2 = 6 листьев; B3 = 8-10 листьев; B4 = образование початков; B5 = физиологическая зрелость. Начиная со стадии 2-4 листьев (А0), применялась органическая обработка, в результате которой получался двухградуальный фактор (А1 = контроль и А2 = обработанный). Корни красной овсяницы собирали при цветении из эксперимента с пятью многолетними оплодотворениями13,14: V1 = контрольный, неоплодотворенный; V2 = 10 т·га-1 навоз; V3 = 10 т·га-1 навоз + N 50 кг·га-1,Р2О5 25 кг·га-1, К2О 25 кг·га-1; V4 = N 100 кг·га-1, P2O5 50 кг·га-1, K2O 50 кг·га-1; V5 = 10 т·га-1 навоз + N 100 кг·га-1,Р2О5 50 кг·га-1, К2О 50 кг·га-1. Пять растений были собраны на каждой стадии развития из каждого варианта удобрения. Проанализированы протоколы окрашивания и их производительность с точки зрения времени обработки образца и качества окрашивания. Связь между развитием гиф АМ и наличием ее структур в корнях анализировалась отдельно для каждого вида и продолжалась выявлением наиболее разрешительных корней для колонизации. Конкретные модели колонизации каждой корневой системы были проанализированы на основе карт колонизации и значения параметров AM.
Кукуруза является однолетним растением, которое подразумевает непрерывный рост корней, и это стало основной причиной применения MycoPatt на стадиях выращивания. Овсяница красная – многолетнее растение с луга, долгое время обработанное различными удобрениями. Его корни имеют более короткое развитие на 1 год, а антез считается точкой вегетации, когда растение меняет свой метаболизм с вегетативного на генеративный. Чтобы поймать эти растения в эти периоды интенсивной активности, были выбраны вышеупомянутые временные точки. Отбор проб в течение вегетационного периода затруднен для этого вида при выращивании на естественных лугах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследования по микоризной колонизации имеют жизненно важное значение для разработки новой стратегии в агрономической области. Потенциал нескольких культурных растений для формирования симбиотической ассоциации с арбускулярными микоризами сделал их важным компонентом устойчивог?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
В этой статье используются данные, полученные в результате двух докторских исследований в тематической области «Кукурузные микоризные модели, обусловленные агрономическими ресурсами», проведенные Викторией Поп-Молдован, и «Микоризный статус и развитие колонизации в горных пастбищных доминирующих видах», проведенные Ларисой Корцоз под координацией профессора д-ра Роксаны Видикан.
Materials
| Apple vinegar 5% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE MERE | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere |
| Blue Ink | Pelikan | 4001 | https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan |
| Cover slips | Menzel-Glaser | D 263 M | https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser |
| Forceps, PMP | Vitalab | 9.171 411 | http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33 |
| Glass jar 47 mL | Indigo Cards | BORCAN 47 ML HEXAGONAL | https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal |
| Laminating Pouches | Peach | PP525-08 | Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328 |
| Microflow Class II ABS Cabinet | Bioquell UK Ltd | Microflow Class II ABS Cabinet | http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf |
| Microscope slides | Deltalab | D100001 | https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26×76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE |
| Microsoft Office 365 | Microsoft | Office 365 | Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation |
| NaOH | Oltchim | 01-2119457892-27-0065 | http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf |
| Nitrile gloves | SemperGuard | 816780637 | https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE |
| Optika camera | OPTIKA | CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0 | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/ |
| Optika Microscope | OPTIKA | B383pL | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/ |
| Protective mask FFP3 | Hermes Gift | HERMES000100 | EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section |
| Scalpel | Cutfix | 9409814 | https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809 |
| White wine vinegar 9% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE VIN ALB | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb |
References
- Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health. Nature Reviews Microbiology. 18 (11), 607-621 (2020).
- Jeffries, P., Barea, J. M., Hock, B. 4 Arbuscular Mycorrhiza: A Key Component of Sustainable Plant-Soil Ecosystems. The Mycota. IX Fungal Associations. , 51-75 (2012).
- Parniske, M. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses. Nature Reviews Microbiology. 6 (10), 763-775 (2008).
- Gianinazzi, S., et al. Agroecology: The key role of arbuscular mycorrhizas in ecosystem services. Mycorrhiza. 20 (8), 519-530 (2010).
- Lee, E. -. H., Eo, J. -. K., Ka, K. -. H., Eom, A. -. H. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi and their roles in ecosystems. Mycobiology. 41 (3), 121-125 (2013).
- Zhang, Y., Zeng, M., Xiong, B., Yang, X. Ecological significance of arbuscular mycorrhiza biotechnology in modern agricultural system. Ying Yong Sheng Tai Xue Bao = The Journal of Applied Ecology. 14 (4), 613-617 (2003).
- Shah, A. A., et al. Effect of endophytic Bacillus megaterium colonization on structure strengthening, microbial community, chemical composition and stabilization properties of Hybrid Pennisetum. Journal of the Science of Food and Agriculture. 100 (3), 1164-1173 (2020).
- Souza, T. . Handbook of Arbuscular Mycorrhizal Fungi. , (2015).
- Sun, X. -. G., Tang, M. Comparison of four routinely used methods for assessing root colonization by arbuscular mycorrhizal fungi. Botany. 90 (11), 1073-1083 (2012).
- Smith, S., Read, D., Smith, S. E., Read, D. J. Colonization of Roots and Anatomy of Arbuscular Mycorrhiza. Mycorrhizal Symbiosis. , 42-90 (2008).
- Stoian, V., et al. Sensitive approach and future perspectives in microscopic patterns of mycorrhizal roots. Scientific Reports. 9 (1), 10233 (2019).
- Pop-Moldovan, V., et al. Divergence in corn mycorrhizal colonization patterns due to organic treatment. Plants. 10 (12), 2760 (2021).
- Corcoz, L., et al. Mycorrhizal patterns in the roots of dominant Festuca rubra in a high-natural-value grassland. Plants. 11 (1), 112 (2021).
- Corcoz, L., et al. Deciphering the colonization strategies in roots of long-term fertilized Festuca rubra. Agronomy. 12 (3), 650 (2022).
- Stoian, V., Florian, V. Mycorrhiza – Benefits, influence, diagnostic method. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca. Agriculture. 66 (1), 2009 (2009).
- Prates Júnior, P., et al. Agroecological coffee management increases arbuscular mycorrhizal fungi diversity. PLoS One. 14 (1), 0209093 (2019).
- Rillig, M. C., et al. Why farmers should manage the arbuscular mycorrhizal symbiosis. New Phytologist. 222 (3), 1171-1175 (2019).
- Rillig, M. C., et al. Towards an integrated mycorrhizal technology: Harnessing mycorrhiza for sustainable intensification in agriculture. Frontiers in Plant Science. 7, 1625 (2016).
- Bhale, U. N., Bansode, S. A., Singh, S., Gehlot, P., Singh, J. Multifactorial Role of Arbuscular Mycorrhizae in Agroecosystem. Fungi and their Role in Sustainable Development: Current Perspectives. , 205-220 (2018).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
- Vaida, I., Păcurar, F., Rotar, I., Tomoș, L., Stoian, V. Changes in diversity due to long-term management in a high natural value grassland. Plants. 10 (4), 739 (2021).
- . The International Collection of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhizal Fungi Available from: https://invam.wvu.edu/collection (2022)
- . The International Bank for the Glomeromycota Available from: https://www.i-beg.eu/ (2022)
