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Biology

Modello di aneurisma dell'aorta addominale del topo indotto dall'applicazione perivascolare dell'elastasi

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63608
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Internal Medicine, Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Il presente protocollo descrive un metodo chirurgico standardizzato per il modello AAA indotto da elastasi attraverso l'applicazione diretta di elastasi all'avventizia dell'aorta addominale infrarenale nei topi.

Abstract

L'aneurisma dell'aorta addominale (AAA), sebbene principalmente asintomatico, è potenzialmente pericoloso per la vita in quanto la rottura di AAA di solito ha un esito devastante. Attualmente, ci sono diversi modelli sperimentali distinti di AAA, ognuno dei quali enfatizza un aspetto diverso nella patogenesi di AAA. Il modello AAA indotto da elastasi è il secondo modello AAA di roditore più utilizzato. Questo modello prevede l'infusione diretta o l'applicazione di elastasi pancreatica suina (PPE) al segmento infrarenale dell'aorta. A causa di sfide tecniche, la maggior parte dei modelli AAA indotti da elastasi al giorno d'oggi viene eseguita con l'applicazione esterna piuttosto che con un'infusione intraluminale di DPI. L'infiltrazione di elastasi causerà la degradazione delle lamelle elastiche negli strati mediali, con conseguente perdita dell'integrità della parete aortica e successiva dilatazione dell'aorta addominale. Tuttavia, uno svantaggio del modello AAA indotto da elastasi è l'inevitabile variazione di come viene eseguito l'intervento chirurgico. In particolare, la tecnica chirurgica di isolamento del segmento infrarenale dell'aorta, il materiale utilizzato per l'avvolgimento dell'aorta e l'incubazione dei DPI, l'attività enzimatica dei DPI e la durata temporale dell'applicazione dei DPI possono essere tutti determinanti importanti che influenzano l'eventuale tasso di formazione dell'AAA e il diametro dell'aneurisma. In particolare, la differenza in questi fattori da diversi studi sull'AAA può portare a problemi di riproducibilità. Questo articolo descrive un processo chirurgico dettagliato del modello AAA indotto da elastasi attraverso l'applicazione diretta di DPI all'avventizia dell'aorta addominale infrarenale nel topo. Seguendo questa procedura, è possibile ottenere un tasso di formazione AAA stabile di circa l'80% nei topi maschi e femmine. La coerenza e la riproducibilità degli studi AAA che utilizzano un modello AAA indotto dall'elastasi possono essere significativamente migliorate stabilendo una procedura chirurgica standard.

Introduction

L'aneurisma dell'aorta addominale (AAA) è definito come una dilatazione segmentale dell'aorta addominale con un aumento di almeno il 50% del diametro del vaso1. L'AAA è potenzialmente fatale, in quanto la rottura può comportare un tasso di mortalità estremamente elevato, anche con l'intervento 2,3,4. È stato riferito che aAA è responsabile di circa 13.000 morti all'anno negli Stati Uniti, il che lo rende la10a causa di morte 1,5.

La patogenesi dell'AAA non è ancora del tutto compresa 6,7,8. Per studiare il meccanismo molecolare dell'AAA e testare potenziali bersagli terapeutici, sono stati stabiliti diversi modelli sperimentali di AAA 9,10. I modelli di roditori di AAA includono modelli di elastasi, cloruro di calcio, angiotensina II e xenotrapianto, tra i quali il modello AAA indotto da elastasi è il secondo modello più utilizzato 10,11,12,13,14,15,16,17. Questo modello prevede l'infusione diretta o l'applicazione di elastasi pancreatica suina (PPE) al segmento infrarenale dell'aorta. La penetrazione dell'elastasi nello strato mediale dell'aorta causerà la degradazione delle lamelle elastiche e l'infiltrazione delle cellule infiammatorie, portando alla perdita dell'integrità della parete aortica e alla successiva dilatazione dell'aorta addominale 7,18. Il modello AAA indotto da elastasi è stato riportato per la prima volta da Anidjar et al. nel 1990 utilizzando ratti, in cui un segmento isolato dell'aorta è stato perfuso con elastasi17. Più tardi, nel 2012, un modello modificato che utilizza un'applicazione periavventiziale di DPI è stato riportato da Bhamidipati et al.19. Al giorno d'oggi, la maggior parte degli interventi chirurgici per il modello AAA indotto da elastasi sono ispirati al gruppo di Bhamidipati e vengono eseguiti con l'applicazione esterna piuttosto che con la perfusione intraluminale di DPI. Sebbene l'applicazione esterna abbia meno requisiti sulle abilità chirurgiche fini, il tasso di incidenza di AAA è relativamente più basso e le dimensioni leggermente inferiori a quelle della perfusione intraluminale11,19.

Sebbene ampiamente utilizzato negli studi AAA, il modello AAA indotto dall'elastasi presenta alcune limitazioni. Un avvertimento di questo modello sono le inevitabili variazioni di come viene eseguito l'intervento chirurgico, che può portare al problema della riproducibilità. Ad esempio, la differenza può esistere nella procedura chirurgica per quanto riguarda il modo in cui il segmento infrarenale dell'aorta è isolato e quale parte del segmento è selezionata per l'applicazione di DPI tra diversi laboratori. Anche l'attività enzimatica dei DPI e la durata dell'incubazione dei DPI possono variare. Questi, tuttavia, sono tutti determinanti essenziali che influenzano l'eventuale tasso di formazione AAA e il diametro dell'aneurisma. La variazione di questi determinanti critici rende molto difficile il confronto dei dati degli studi AAA di diversi gruppi che utilizzano questo modello. Pertanto, è necessaria una procedura chirurgica standardizzata come strumento per ottenere risultati comparabili da varie istituzioni.

Questo articolo descrive un protocollo chirurgico standardizzato per il modello AAA indotto da elastasi attraverso l'applicazione diretta di DPI all'avventizia dell'aorta addominale infrarenale nei topi. Saranno inoltre discussi i dettagli sul materiale chirurgico e le procedure essenziali per una generazione efficace e robusta di AAA nei topi che utilizzano questo modello.

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Protocol

I protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Michigan (PRO00010092). Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi maschi e femmine C57BL / 6J wild-type (WT), a circa 7 settimane di età.

1. Preparazione animale

  1. Nutrire i topi con la dieta standard chow (vedi Tabella dei materiali) prima e dopo l'intervento chirurgico.
    NOTA: È possibile utilizzare diversi ceppi ed età dei topi. Tuttavia, si raccomanda un'età compresa tra 5,5 e 12 settimane per raggiungere il tasso di incidenza massimo.
  2. Per ogni topo, somministrare 5 mg/kg di Carprofene per via sottocutanea 30 minuti prima dell'induzione dell'anestesia.
  3. Dopo 30 minuti, somministrare 100 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg di xilazina tramite iniezione intraperitoneale per indurre l'anestesia.

2. Preparazione per la chirurgia

  1. Preparare il materiale chirurgico.
    1. Tagliare i guanti in nitrile in strisce di 4 cm x 4 mm. Tagliare i tamponi di cotone in pezzi di 3 cm x 2 mm. Autoclave questi con altri strumenti chirurgici, tra cui forbici chirurgiche, pinze tissutali ed emostati Halsted-Mosquito (vedi Tabella dei materiali).
  2. Posizionare il mouse in posizione supina su una pastiglia assorbente sterile. Immobilizzare le zampe anteriori e posteriori con nastro chirurgico.
  3. Utilizzare applicatori con punta di cotone (vedi Tabella dei materiali) per spazzolare la lozione per la rimozione dei capelli sulla zona addominale centrale e inferiore, quindi tamponare l'area con una garza chirurgica per rimuovere i capelli.
  4. Disinfettare l'area chirurgica almeno tre volte con un movimento circolare con applicazioni alternate di alcol al 70% e uno scrub a base di iodio o a base di clorexidina. Lasciare asciugare.

3. Procedura chirurgica

  1. Eseguire i seguenti passaggi per accedere alla cavità addominale.
    1. Testare il mouse per la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi prima dell'incisione cutanea.
    2. Fare un'incisione longitudinale di 2,5 cm sulla pelle lungo la linea mediana dell'addome medio e inferiore usando le forbici chirurgiche.
    3. Tirare delicatamente verso l'alto il muscolo sottostante e fare un'incisione longitudinale di 2,5 cm lungo la linea alba per accedere alla cavità addominale.
  2. Esporre l'aorta addominale.
    1. Utilizzare applicatori con punta di cotone bagnata per spostare l'intestino e lo stomaco sul lato destro del mouse.
      NOTA: Idealmente, questo esporrà il segmento infrarenale dell'aorta. Se l'aorta è difficile da localizzare, il rene destro e l'arteria renale destra possono identificare l'aorta (poiché il rene destro ha una posizione anatomica leggermente inferiore rispetto al rene sinistro).
    2. Utilizzare una pinza per rimuovere delicatamente il tessuto connettivo che copre l'aorta addominale e la vena cava inferiore (IVC).
      NOTA: L'aorta addominale e l'IVC sono contenute all'interno della stessa guaina del vaso. Non è necessario rimuovere tutto il tessuto connettivo poiché la rimozione completa aumenterebbe il rischio di danneggiare questi due vasi.
    3. Utilizzare una pinza per sezionare delicatamente la parte posteriore dell'aorta addominale e IVC dai muscoli sottostanti.
      NOTA: le punte della pinza dovrebbero andare nella parte posteriore della guaina trasversalmente e creare un foro nella fascia che collega la guaina ai muscoli sottostanti. Una volta fatto il foro, estendi le sue dimensioni rilasciando lentamente la pinza.
    4. Posizionare un pezzo della striscia del guanto di 4 cm x 4 mm (come accennato in precedenza, passaggio 2.1.1) attraverso la parte posteriore dell'aorta addominale e dell'IVC, quindi raddrizzare la striscia. Posizionare la striscia a ~ 0,5 cm di distanza dall'arteria renale destra.
      NOTA: assicurarsi che il foro sia abbastanza grande in modo che la fascia circostante non torca la striscia.
    5. Sopra la striscia, posizionare un pezzo di batuffolo di cotone di 3 cm x 2 mm attraverso la parte posteriore dell'aorta addominale e IVC, quindi raddrizzare il batuffolo di cotone.
  3. Incubare l'elastasi.
    1. Utilizzare una pipetta per far cadere 30 μL di elastasi pancreatica suina (attività enzimatica totale di 1,8 unità, vedere Tabella dei materiali) sul segmento dell'aorta sopra il batuffolo di cotone, quindi avvolgere il batuffolo di cotone e strisciare intorno all'aorta e all'IVC. Risciacquare un pezzo di garza di 10 cm x 10 cm con soluzione salina sterile allo 0,9% e posizionarlo sull'addome.
      NOTA: La garza ha bisogno solo di risciacquo parziale in quanto esagerare rischierebbe di diluire l'elastasi sottostante.
    2. Dopo 30 minuti, rimuovere la striscia e il batuffolo di cotone con una pinza.
  4. Chiudere la cavità addominale seguendo i passaggi seguenti.
    1. Irrigare l'aorta e la cavità addominale con 500 μL di soluzione salina sterile allo 0,9%. Utilizzare una garza di 10 cm x 10 cm per assorbire la soluzione salina rimanente.
    2. Riavvicinare gli strati muscolari con una sutura monofilamento non assorbibile 6-0 in esecuzione.
    3. Chiudere la pelle con 3-4 suture monofilamento non assorbibili interrotte 6-0.

4. Assistenza post-operatoria

  1. Somministrare 5 mg/kg di carprofene per via sottocutanea nel giorno 1 post-operatorio.
  2. Rimuovere le suture cutanee il giorno post-operatorio 10.

5. Misurazione del diametro dell'aneurisma dell'aorta addominale

  1. Eutanasia dei topi con sovradosaggio di CO2 il giorno 14 post-operatorio. Questo rappresenta il punto temporale della massima dilatazione.
  2. Accedere alla cavità addominale come descritto al punto 3.1.
  3. Eseguire la perfusione vascolare iniettando 10 ml di soluzione salina allo 0,9% nella circolazione attraverso il ventricolo sinistro.
  4. Esporre il segmento infrarenale dell'aorta addominale come descritto nei passaggi 3.1-3.2. Rimuovere con cura il tessuto connettivo circostante e separare l'aorta addominale dall'IVC.
  5. Misurare il diametro dell'aorta addominale con una pinza.

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Representative Results

Un totale di ventitré topi wild-type (WT) di 7 settimane, tra cui 12 femmine e 11 maschi, sono stati operati seguendo il protocollo presentato. Il tasso di sopravvivenza è stato del 100% (mortalità chirurgica esclusa). Il diametro massimo dell'aorta addominale è stato misurato da una pinza.

L'AAA è stato definito come dilatazione dell'aorta addominale con un aumento del diametro del vaso del 50%. Pertanto, un aumento del 50% del diametro massimo dell'aorta addominale è stato selezionato come punto di interruzione per un'induzione AAA di successo. Sulla base di questo criterio, il tasso di incidenza di AAA nel giorno 14 post-operatorio è stato del 91,7% per le femmine, con 11 su 12 che hanno subito un intervento chirurgico sviluppato AAA; mentre il tasso di incidenza per gli animali maschi è stato del 72,7%, con 8 su 11 che hanno subito un intervento chirurgico hanno sviluppato AAA (Figura 1A). Tra i 19 animali in cui si verifica l'AAA, c'è un aumento di 1,7 volte e 1,6 volte del diametro massimo dell'aorta addominale nelle femmine e nei maschi rispetto ai controlli non chirurgici, rispettivamente (Figura 1B). Le immagini rappresentative delle aorte provenienti da gruppi non chirurgici e chirurgici nel giorno 14 post-operatorio sono mostrate nella Figura 1C.

Figure 1
Figura 1: Caratterizzazione dell'AAA in topi sottoposti a intervento chirurgico. Tutte le misurazioni vengono effettuate il giorno 14 post-operatorio. (A) Il tasso di incidenza di AAA nei topi sottoposti a intervento chirurgico. (B) Diametro massimo dell'aorta infrarenale nei topi sia da gruppi non chirurgici (n = 4 sia per femmina che per maschio) e chirurgici (n = 12 per femmina; n = 11 per maschio). I dati sono medi ± SEM. *p < 0,05. (C) Immagini rappresentative di aorte nei topi di entrambi i gruppi non chirurgici e chirurgici. Barra della scala = 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il modello AAA indotto da elastasi è stato riportato per la prima volta da Anidjar et al. usando ratti nel 199017. Una varietà di versioni modificate sono state introdotte negli ultimi trent'anni, insieme a un significativo miglioramento delle tecniche chirurgiche 19,20,21,22. Centinaia di istituti utilizzano modelli AAA indotti da elastasi come secondo modello sperimentale di roditori più utilizzato per gli studi AAA12. È naturale che diversi gruppi eseguiranno l'intervento chirurgico per questo modello in modo leggermente diverso. Di conseguenza, un avvertimento di questo modello sono le inevitabili variazioni di come viene eseguito l'intervento chirurgico, il che rende molto difficile il confronto dei dati di diversi gruppi che utilizzano questo modello. Le variazioni includono, ma non sono limitate a come viene esposto il segmento infrarenale dell'aorta, quanto ampiamente viene pulito lo strato fasciale che copre l'aorta, quanto è lungo il periodo di incubazione, così come il materiale utilizzato per l'avvolgimento dell'aorta e l'incubazione dell'elastasi e il volume di elastasi aggiunto al materiale di avvolgimento. Questi, tuttavia, sono tutti determinanti essenziali che influenzano l'eventuale tasso di incidenza e il diametro dell'AAA. È necessaria una procedura chirurgica standardizzata per risolvere il problema della riproducibilità causato da queste variazioni. Un protocollo chirurgico standardizzato è presentato qui per il modello AAA indotto da elastasi attraverso l'applicazione diretta di DPI all'avventizia dell'aorta addominale infrarenale nel topo.

Oltre al costante tasso di induzione di AAA, questo protocollo possiede i vantaggi di basse spese e tempi di funzionamento brevi. Il materiale chirurgico utilizzato in questo protocollo può essere facilmente ottenuto a costi contenuti. Il tempo medio di funzionamento di questo protocollo è di 50 minuti, inclusi 30 minuti di incubazione dei DPI. Questi vantaggi consentiranno la conduzione più facile di molti studi sugli animali, contribuendo a una maggiore potenza statistica e riproducibilità.

L'esposizione dell'aorta addominale è il passo più critico in questo protocollo. È essenziale rimuovere il tessuto connettivo nella guaina del vaso che circonda l'aorta addominale e l'IVC in modo che l'elastasi abbia maggiori possibilità di penetrare nello strato mediale dell'aorta. Tuttavia, la rimozione completa di questi tessuti connettivi richiede molto tempo e rischia di danneggiare l'aorta sottostante e l'IVC. Questo è il passo da cui viene causata la maggior parte della mortalità chirurgica. Se l'IVC o l'aorta sono danneggiati, la maggior parte degli animali non sopravviverà alle successive 48 ore anche se sopravvivono all'intervento chirurgico, probabilmente a causa del sanguinamento continuo dopo l'intervento chirurgico che porta al dissanguamento. Per questo motivo, un delicato equilibrio tra esporre l'aorta nella massima misura e non danneggiare i grandi vasi deve essere ponderato. Lasciare una piccola quantità di tessuto connettivo sulla guaina del vaso ridurrà significativamente la mortalità perioperatoria senza influenzare l'insorgenza di AAA. Pertanto, non è consigliabile rimuovere completamente il tessuto connettivo che copre l'aorta e l'IVC per l'esposizione all'aorta addominale. Tuttavia, è necessario prestare estrema attenzione durante l'aorta addominale e la dissezione IVC dal tessuto connettivo adiacente.

Anatomicamente, l'aorta addominale e l'IVC sono strettamente attaccati tramite un sottile strato di fascia e contenuti insieme nella stessa guaina del vaso. Alcuni modelli sperimentali come la trombosi venosa possono richiedere la separazione dell'aorta dall'IVC adiacente. Tuttavia, non è necessario farlo nel modello AAA23 indotto dall'elastasi. Alcuni potrebbero preferire ruotare la guaina del vaso in senso orario in modo che l'aorta sia proprio sopra IVC e l'elastasi possa quindi essere applicata direttamente all'aorta. Ciò non è necessario in quanto il batuffolo di cotone sottostante è saturo di elastasi e l'aorta sarà continuamente esposta all'elastasi indipendentemente dalla sua relazione anatomica con l'IVC. Si raccomanda che la parte posteriore dell'aorta e dell'IVC siano adeguatamente separate dai muscoli sottostanti tramite pinza. Nel caso in cui la dissezione non sia abbastanza estesa in questa fase, la forza di tensione verrà creata dalla fascia e dai muscoli circostanti sulla striscia e sul batuffolo di cotone, con conseguente torsione e successiva assorbanza inefficiente dell'elastasi.

Una limitazione di questo protocollo è l'eventuale forma dell'AAA indotto. È inevitabile che quando viene lasciata cadere sull'aorta, una certa elastasi fluisca verso altri segmenti dell'aorta che non sono avvolti dal batuffolo di cotone. Inoltre, il sanguinamento nelle vicinanze causato dalla dissezione, anche di piccola quantità, può lavare l'elastasi dal batuffolo di cotone ad altri segmenti dell'aorta durante il periodo di incubazione di 30 minuti. Questi porteranno all'elastasi penetrando in altri segmenti dell'aorta, causando così la rottura dello strato mediale e la dilatazione dell'aorta addominale non limitata al segmento avvolto dal batuffolo di cotone. Di conseguenza, invece di esibire aneurismi a forma fusiforme causati dalla dilatazione focale, alcuni animali dimostrano una dilatazione generale di un lungo segmento dell'aorta addominale. Tuttavia, il diametro massimo dell'aorta in questi animali che hanno una dilatazione continua dell'aorta mostra ancora un aumento di oltre il 50% rispetto ai controlli. Nel frattempo, non si osserva alcuna differenza nel diametro massimo dell'aorta tra gli animali che mostrano una dilatazione continua e una dilatazione focale dell'aorta addominale, suggerendo che la forma dell'aneurisma non è un indicatore né dell'induzione AAA riuscita né della dimensione effettiva dell'AAA in questo caso protocollo.

Un'altra limitazione di questo protocollo è l'applicazione di questo metodo agli animali più grandi. Il modello AAA topico indotto da elastasi deve essere facilmente applicato ad altri piccoli animali come i ratti. Tuttavia, l'elastasi da sola potrebbe non essere sufficiente per animali più grandi come maiali o primati per indurre un fenotipo AAA coerente. Ad esempio, Marinov et al. hanno riferito che la sola perfusione di elastasi nei suini potrebbe causare alcuni cambiamenti istologici, tra cui l'interruzione dell'elastina, ma non potrebbe indurre un aneurisma coerente24. Shannon A et al. hanno riportato un modello suino di AAA infrarenale indotto da elastasi. Tuttavia, richiede una combinazione di angioplastica con palloncino, perfusione, elastasi topica e una dieta contenente BAPN (un inibitore della lisil ossidasi che previene la reticolazione del collagene) data la notevole durata dell'aorta25. Pertanto, sembra che l'applicazione di un protocollo AAA standardizzato indotto dall'elastasi in animali più grandi sia ancora piuttosto impegnativa a causa della differenza di dimensioni e durata dell'aorta tra topi e animali più grandi, delle sfide tecniche e del costo potenzialmente elevato.

In sintesi, nonostante alcune limitazioni, l'AAA può essere indotta in modo coerente sia nei topi maschi che in quelli femmine in questo protocollo standardizzato. Si prevede che la coerenza e la riproducibilità degli studi AAA che utilizzano il modello AAA indotto da elastasi saranno significativamente migliorate stabilendo questa procedura chirurgica standard.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo l'Unità per la Medicina Animale da Laboratorio dell'Università del Michigan per il loro aiuto con l'alimentazione e l'allevamento degli animali. Questo studio è supportato da NIH RO1 HL138139, NIH RO1 HL153710 a J. Zhang, NIH RO1 HL109946, RO1 HL134569 a Y.E. Chen e l'American Heart Association concede 20POST35110064 a G. Zhao.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 non-absorbable monofilament suture Pro Advantage P420697
Carprofen Zoetis Inc. NDC: 54771-8507
Chow Diet LabDiet 3005659-220 PicoLab 5L0D
Cotton Applicator Dynarex 4303
Cotton Pad Rael UPC: 810027130969
GraphPad Prism 8 GraphPad Software Inc. Version 8.4.3
Grarfe Forceps Fine Science Tools 11051-10
Halsted Mosquito Hemostats Fine Science Tools 13009-12
Ketamine Par Pharmaceutical NDC: 42023-0115-10
Nitrile gloves Fisherbrand 19-130-1597
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122
Porcine pancreatic elastase Sigma-Aldrich E1250-100MG
Scissors Fine Science Tools 14068-12
Sterile 0.9% saline solution Baxter 2B1324X
Xylazine Akorn NDC: 59399-110-20

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Biologia Numero 180
Modello di aneurisma dell'aorta addominale del topo indotto dall'applicazione perivascolare dell'elastasi
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Xue, C., Zhao, G., Zhao, Y., Chen,… More

Xue, C., Zhao, G., Zhao, Y., Chen, Y. E., Zhang, J. Mouse Abdominal Aortic Aneurysm Model Induced by Perivascular Application of Elastase. J. Vis. Exp. (180), e63608, doi:10.3791/63608 (2022).

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