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Biology

Modelo de Aneurisma De aootico Abdominal do Rato Induzido pela Aplicação Perivascular do Elastase

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63608
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Internal Medicine, Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

O presente protocolo descreve um método cirúrgico padronizado para o modelo AAA induzido por elastase através da aplicação direta de elastase à adventitia da aorta abdominal infrarenal em camundongos.

Abstract

O aneurisma de aorta abdominal (AAA), embora principalmente assintomático, é potencialmente fatal, pois a ruptura do AAA geralmente tem um resultado devastador. Atualmente, existem vários modelos experimentais distintos de AAA, cada um enfatizando um aspecto diferente na patogênese do AAA. O modelo AAA induzido por elastase é o segundo modelo AAA de roedor mais usado. Este modelo envolve infusão direta ou aplicação de elastase pancreática porcina (EPI) ao segmento infrarenal da aorta. Devido a desafios técnicos, o modelo AAA mais induzido por elastase atualmente é realizado com a aplicação externa em vez de uma infusão intraluminal de EPI. A infiltração da elastase causará degradação de lamellae elástica nas camadas medial, resultando na perda da integridade da parede aórtica e posterior dilatação da aorta abdominal. No entanto, uma desvantagem do modelo AAA induzido por elastase é a inevitável variação de como a cirurgia é realizada. Especificamente, a técnica cirúrgica de isolar o segmento infrarenal da aorta, o material utilizado para embrulho de aorta e incubação de EPI, a atividade enzimática de EPI e a duração do tempo de aplicação de EPI podem ser determinantes importantes que afetam a eventual taxa de formação AAA e o diâmetro do aneurisma. Notavelmente, a diferença desses fatores de diferentes estudos sobre AAA pode levar a problemas de reprodutibilidade. Este artigo descreve um processo cirúrgico detalhado do modelo AAA induzido por elastase através da aplicação direta de EPI à adventitia da aorta abdominal infrarenal no camundongo. Após este procedimento, uma taxa de formação AAA estável de cerca de 80% em camundongos machos e fêmeas é alcançável. A consistência e a reprodutibilidade dos estudos AAA usando um modelo AAA induzido por elastase podem ser significativamente aprimoradas estabelecendo um procedimento cirúrgico padrão.

Introduction

O aneurisma de aorta abdominal (AAA) é definido como uma dilatação segmental da aorta abdominal com pelo menos 50% de aumento do diâmetro do vaso1. AAA é potencialmente fatal, pois a ruptura pode resultar em uma taxa de mortalidade extremamente alta, mesmo com a intervenção 2,3,4. Foi relatado que a AAA é responsável por aproximadamente 13.000 mortes anualmente nos EUA, o que faz dele a10ª principal causa de morte 1,5.

A patogênese do AAA ainda não é totalmente compreendida 6,7,8. Para investigar o mecanismo molecular do AAA e testar potenciais alvos terapêuticos, vários modelos experimentais de AAA foram estabelecidos 9,10. Os modelos de AAA de roedores incluem modelos de elastácio, cloreto de cálcio, angiotensina II e xenoenxerto, entre os quais o modelo AAA induzido por elastase é o segundo modelo mais utilizado 10,11,12,13,14,15,16,17. Este modelo envolve infusão direta ou aplicação de elastase pancreática porcina (EPI) ao segmento infrarenal da aorta. A penetração da elastase na camada medial da aorta causará degradação de lamellae elástica e infiltração de células inflamatórias, levando à perda da integridade da parede aórtica e à subsequente dilatação da aorta abdominal 7,18. O modelo AAA induzido por elastase foi relatado pela primeira vez por Anidjar et al. em 1990 usando ratos, no qual um segmento isolado da aorta foi perfundido com elastase17. Mais tarde, em 2012, um modelo modificado usando uma aplicação periadventitial de EPI foi relatado por Bhamidipati et al.19. Atualmente, a maioria das cirurgias para o modelo AAA induzido por elastase são inspiradas no grupo de Bhamidipati e são realizadas com a aplicação externa em vez de perfusão intraluminal de EPI. Embora a aplicação externa tenha menor exigência de habilidades cirúrgicas finas, a taxa de incidência de AAA é relativamente menor e tamanho um pouco menor do que o da perfusão intraluminal11,19.

Embora amplamente utilizado em estudos AAA, o modelo AAA induzido por elastase possui certas limitações. Uma ressalva desse modelo são as variações inevitáveis de como a cirurgia é realizada, o que pode levar à questão da reprodutibilidade. Por exemplo, pode existir a diferença no procedimento cirúrgico sobre como o segmento infrarenal da aorta é isolado e qual parte do segmento é selecionada para aplicação de EPI entre diferentes laboratórios. A atividade enzimática do EPI e a duração do tempo de incubação de EPI também podem variar. Estes, no entanto, são todos determinantes essenciais que afetam a eventual taxa de formação AAA e o diâmetro do aneurisma. A variação desses determinantes críticos torna muito difícil a comparação de dados de estudos AAA de diferentes grupos que utilizam esse modelo. Portanto, é necessário um procedimento cirúrgico padronizado como ferramenta para obter resultados comparáveis de várias instituições.

Este artigo descreve um protocolo cirúrgico padronizado para o modelo AAA induzido por elastase através da aplicação direta de EPI à adventitia da aorta abdominal infrarenal em camundongos. Detalhes sobre material cirúrgico e procedimentos essenciais para a geração bem-sucedida e robusta de AAA em camundongos usando este modelo também serão discutidos.

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Protocol

Os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan (PRO00010092). Camundongos machos e fêmeas C57BL/6J (WT), ~7 semanas de idade, foram usados para os experimentos.

1. Preparação animal

  1. Alimente os camundongos com a dieta padrão de chow (ver Tabela de Materiais) antes e depois da cirurgia.
    NOTA: Podem ser utilizadas diferentes cepas e idades dos ratos. No entanto, recomenda-se idade que varia entre 5,5 e 12 semanas de idade para atingir a taxa máxima de incidência.
  2. Para cada rato, administre 5 mg/kg de Carprofen subcutâneamente 30 min antes da indução da anestesia.
  3. Após 30 min, administre 100 mg/kg de cetamina e 5mg/kg de Xylazine via injeção intraperitoneal para induzir anestesia.

2. Preparação para cirurgia

  1. Prepare o material cirúrgico.
    1. Corte as luvas de nitrito em tiras de 4 cm x 4 mm. Corte as almofadas de algodão em pedaços de 3 cm x 2 mm. Autoclave-os com outros instrumentos cirúrgicos, incluindo tesoura cirúrgica, fórceps teciduais e hemostatos halsted-mosquito (ver Tabela de Materiais).
  2. Coloque o mouse na posição supina em um absorvente estéril. Imobilize as patas dianteiras e traseiras com fita cirúrgica.
  3. Use aplicadores com ponta de algodão (ver Tabela de Materiais) para escovar a loção de removedor de cabelo sobre a área abdominal média e inferior, em seguida, cotonhar a área com gaze cirúrgica para remover o cabelo.
  4. Desinfetar a área cirúrgica pelo menos três vezes em um movimento circular com aplicações alternadas de 70% de álcool e um esfoliante à base de iodo ou clorexidina. Deixe secar.

3. Procedimento cirúrgico

  1. Realize as seguintes etapas para acessar a cavidade abdominal.
    1. Teste o mouse para a falta de resposta de dedo do dedo do dedo antes da incisão da pele.
    2. Faça uma incisão longitudinal de 2,5 cm na pele ao longo da linha média do abdômen médio e inferior usando uma tesoura cirúrgica.
    3. Puxe suavemente o músculo subjacente e faça uma incisão longitudinal de 2,5 cm ao longo da linhaa alba para acessar a cavidade abdominal.
  2. Exponha a aorta abdominal.
    1. Use aplicadores com ponta de algodão molhados para mover os intestinos e o estômago para o lado direito do mouse.
      NOTA: Idealmente, isso irá expor o segmento infrarenal da aorta. Se a aorta for difícil de localizar, o rim direito e a artéria renal direita podem identificar a aorta (já que o rim direito tem uma localização anatômica ligeiramente menor do que o rim esquerdo).
    2. Use fórceps para remover suavemente o tecido conjuntivo que cobre a aorta abdominal e a veia cava inferior (IVC).
      NOTA: A aorta abdominal e o IVC estão contidos na mesma baia do vaso. É desnecessário remover todo o tecido conjuntivo, pois a remoção completa aumentaria o risco de danificar esses dois vasos.
    3. Use fórceps para dissecar suavemente a parte traseira da aorta abdominal e IVC dos músculos subjacentes.
      NOTA: As pontas das fórceps devem ir para a parte de trás da bainha transversalmente e criar um buraco na fáscia que conecta a bainha aos músculos subjacentes. Uma vez feito o orifício, estenda seu tamanho liberando lentamente os fórceps.
    4. Coloque um pedaço da faixa de luva de 4 cm x 4 mm (como mencionado anteriormente, passo 2.1.1) através da parte traseira da aorta abdominal e IVC, em seguida, endireitar a listra. Coloque a listra ~0,5 cm de distância da artéria renal direita.
      NOTA: Certifique-se de que o orifício é grande o suficiente para que a fáscia circundante não torça a listra.
    5. Acima da listra, coloque um pedaço de 3 cm x 2 mm de algodão pela parte de trás da aorta abdominal e IVC, em seguida, endireitar a almofada de algodão.
  3. Incubar o elastase.
    1. Use uma pipeta para soltar 30 μL de elastase pancreática porcina (atividade enzimática total de 1,8 unidade, ver Tabela de Materiais) no segmento de aorta acima do bloco de algodão, em seguida, enrole o bloco de algodão e listra ao redor da aorta e IVC. Enxágüe um pedaço de gaze de 10 cm x 10 cm com soro fisiológico e coloque-o no abdômen.
      NOTA: A gaze precisa apenas de lavagem parcial, pois o exagero correria o risco de diluir o elastase abaixo.
    2. Depois de 30 min, remova a listra e a almofada de algodão com fórceps.
  4. Feche a cavidade abdominal seguindo os passos abaixo.
    1. Irrigar a aorta e a cavidade abdominal com 500 μL de soro fisiológico estéril de 0,9%. Use uma gaze de 10 cm x 10 cm para absorver o salino restante.
    2. Reaproximar as camadas musculares com uma sutura de monofilamento não absorvível de 6-0.
    3. Pele próxima com 3-4 interrompidas 6-0 suturas monofilamentos não absorvíveis.

4. Cuidados pós-operatórios

  1. Administrar 5mg/kg de Carprofen subcutâneamente no dia 1 pós-operatório.
  2. Remova as suturas da pele no dia 10 pós-operatório.

5. Medição do diâmetro do aneurisma de aorta abdominal

  1. Eutanize os ratos por CO2 sobredosagem no dia 14 pós-operatório. Isso representa o ponto de tempo da dilatação máxima.
  2. Acesse a cavidade abdominal conforme descrito na etapa 3.1.
  3. Realize a perfusão vascular injetando 10 mL de soro fisiológico de 0,9% na circulação através do ventrículo esquerdo.
  4. Expor o segmento infrarenal da aorta abdominal conforme descrito nas etapas 3.1-3.2. Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo circundante e separe a aorta abdominal do IVC.
  5. Meça o diâmetro da aorta abdominal com uma pinça.

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Representative Results

Um total de vinte e três camundongos do tipo selvagem (WT) de 7 semanas, incluindo 12 fêmeas e 11 machos, foram operados seguindo o protocolo apresentado. A taxa de sobrevivência foi de 100% (exclusão da mortalidade cirúrgica). O diâmetro da aorta abdominal máxima foi medido por uma pinça.

AAA foi definida como dilatando a aorta abdominal com um aumento de 50% no diâmetro do vaso. Por isso, foi selecionado um aumento de 50% no diâmetro máximo da aorta abdominal como ponto de corte para a indução AAA bem sucedida. Com base nesse critério, a taxa de incidência de AAA no dia 14 pós-operatório foi de 91,7% para animais do sexo feminino, sendo que 11 dos 12 submetidos à cirurgia desenvolveram AAA; enquanto a taxa de incidência para animais do sexo masculino foi de 72,7%, com 8 em cada 11 que foram submetidos à cirurgia desenvolveram AAA (Figura 1A). Entre os 19 animais em que ocorre a AAA, há um aumento de 1,7 vezes e 1,6 vezes do diâmetro máximo da aorta abdominal em fêmeas e machos em comparação com os controles não cirúrgicos, respectivamente (Figura 1B). Imagens representativas das aortas de grupos não cirúrgicos e cirúrgicos no dia 14 pós-operatório são mostradas na Figura 1C.

Figure 1
Figura 1: Caracterização de AAA em camundongos submetidos a cirurgia. Toda a medição é feita no dia 14 pós-operatório. (A) A taxa de incidência de AAA em camundongos submetidos à cirurgia. (B) Diâmetro máximo da aorta infrarenal em camundongos de ambos os grupos não cirúrgicos (n = 4 para feminino e masculino) quanto para grupos cirúrgicos (n = 12 para mulher; n = 11 para masculino). Os dados são ± MEI. *p < 0,05. (C) Imagens representativas de aortas em camundongos de grupos não cirúrgicos e cirúrgicos. Barra de escala = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O modelo AAA induzido por elastase foi relatado pela primeira vez por Anidjar et al. usando ratos em 199017. Uma variedade de versões modificadas foram introduzidas nos últimos trinta anos, juntamente com uma melhora significativa nas técnicas cirúrgicas 19,20,21,22. Centenas de institutos usam modelos AAA induzidos por elastase como o segundo modelo experimental de roedores mais usado para estudos AAA12. É natural que diferentes grupos realizem a cirurgia para este modelo de forma ligeiramente diferente. Como resultado, uma ressalva desse modelo são as variações inevitáveis de como a cirurgia é realizada, o que dificulta muito a comparação de dados de diferentes grupos que utilizam esse modelo. As variações incluem, mas não se limitam à exposição do segmento infrarenal da aorta, quão extensivamente a camada fascial que cobre a aorta é limpa, quanto tempo é o período de incubação, bem como o material utilizado para a incubação da aorta e a incubação de elastase e o volume de elastase adicionado ao material de embalagem. Estes, no entanto, são todos determinantes essenciais que afetam a eventual taxa de incidência e diâmetro do AAA. É necessário um procedimento cirúrgico padronizado para resolver a questão da reprodutibilidade causada por essas variações. Um protocolo cirúrgico padronizado é apresentado aqui para o modelo AAA induzido por elastase através da aplicação direta de EPI à adventitia da aorta abdominal infrarenal no camundongo.

Além da taxa de indução consistente do AAA, este protocolo possui as vantagens de baixos gastos e curto tempo de operação. O material cirúrgico utilizado neste protocolo pode ser facilmente obtido a baixos custos. O tempo médio de funcionamento deste protocolo é de 50 min, incluindo 30 min de incubação de EPI. Essas vantagens permitirão a condução mais fácil de muitos estudos em animais, contribuindo para um poder estatístico mais substancial e a reprodutibilidade.

A exposição da aorta abdominal é o passo mais crítico neste protocolo. É essencial remover o tecido conjuntivo na baia do vaso que envolve a aorta abdominal e o IVC para que elastase tenha mais chances de penetrar na camada medial da aorta. No entanto, remover completamente esses tecidos conjuntivos é demorado e corre o risco de danificar a aorta e o IVC subjacentes. Este é o passo a partir do qual a maior parte da mortalidade cirúrgica é causada. Se o IVC ou a aorta estiver danificado, a maioria dos animais não sobreviverá às seguintes 48h, mesmo que sobrevivam à cirurgia, possivelmente devido à hemorragia contínua após a cirurgia que leva à exsanguinação. Por essa razão, um delicado equilíbrio entre expor a aorta em maior medida e não danificar os grandes vasos precisa ser ponderado. Deixar uma pequena quantidade de tecido conjuntivo na bainha do vaso reduzirá significativamente a mortalidade perioperatória, não afetando a ocorrência da AAA. Portanto, não é recomendável remover completamente o tecido conjuntivo que cobre a aorta e o IVC para exposição à aorta abdominal. Ainda assim, é preciso ter extrema cautela durante a aorta abdominal e dissecção de IVC do tecido conjuntivo adjacente.

Anatomicamente, a aorta abdominal e o IVC são intimamente ligados através de uma fina camada de fáscia e contidos juntos na mesma bainha de vaso. Alguns modelos experimentais, como trombose venosa, podem exigir a separação da aorta do IVC adjacente. No entanto, é desnecessário fazê-lo no modelo AAA induzido por elastase23. Alguns podem preferir girar a baia do vaso no sentido horário para que a aorta esteja logo acima de IVC, e elastase pode então ser aplicada diretamente à aorta. Isso é desnecessário, pois a almofada de algodão abaixo está saturada de elastase, e a aorta será continuamente exposta à elastóstase, independentemente de sua relação anatômica com o IVC. Recomenda-se que a parte traseira da aorta e do IVC sejam adequadamente separadas dos músculos subjacentes através de fórceps. Caso a dissecção não seja extensa o suficiente nesta etapa, a força de tensão será criada pela fáscia circundante e músculos na faixa e almofada de algodão, resultando em sua torção e subsequente absorvência ineficiente de elastase.

Uma limitação deste protocolo é a eventual forma do AAA induzido. É inevitável que, ao ser jogado na aorta, algum elastase flua para outros segmentos da aorta que não são embrulhados pela almofada de algodão. Além disso, o sangramento nas proximidades causado pela dissecção, mesmo de pequena quantidade, pode lavar elastase longe da almofada de algodão para outros segmentos de aorta durante o período de incubação de 30 minutos. Estes levarão à elastase penetrando em outros segmentos da aorta, causando assim a quebra da camada medial e a dilatação da aorta abdominal não se limitando ao segmento embrulhado pela almofada de algodão. Como resultado, em vez de exibir aneurismas em forma de fusiforme causados pela dilatação focal, alguns animais demonstram dilatação geral de um longo segmento da aorta abdominal. No entanto, o diâmetro máximo da aorta nesses animais que possuem dilatação contínua da aorta ainda apresenta um aumento de mais de 50% quando comparado com os controles. Enquanto isso, não é observada diferença no diâmetro máximo da aorta entre animais que apresentam dilatação contínua e dilatação focal da aorta abdominal, sugerindo que a forma do aneurisma é um indicador de indução AAA não bem sucedida nem tamanho AAA real neste protocolo de caso.

Outra limitação deste protocolo é aplicar este método a animais maiores. O modelo AAA induzido por elastase tópico deve ser facilmente aplicado a outros animais pequenos, como ratos. No entanto, elastase sozinha pode não ser suficiente para animais maiores como porcos ou primatas induzirem um fenótipo AAA consistente. Por exemplo, Marinov et al. relataram que a perfusão elastase sozinha no suíno poderia causar algumas alterações histológicas, incluindo a interrupção da elastina, mas não poderia induzir um aneurismaconsistente 24. Shannon A et al. relataram um modelo suíno de AAA infrarenal induzido por elastase. No entanto, requer uma combinação de angioplastia de balão, perfusão, elastase tópica e uma dieta contendo BAPN (um inibidor de oxidase lysyl impedindo a ligação cruzada de colágeno) dada a considerável durabilidade da aorta25. Portanto, parece que a aplicação de um protocolo AAA induzido por elastase padronizado em animais maiores ainda é bastante desafiadora devido à diferença de tamanho e durabilidade da aorta entre camundongos e animais maiores, os desafios técnicos e o custo potencialmente alto.

Em resumo, apesar de algumas limitações, o AAA pode ser induzido consistentemente em camundongos masculinos e femininos neste protocolo padronizado. Espera-se que a consistência e a reprodutibilidade dos estudos AAA utilizando o modelo AAA induzido por elastase sejam significativamente aprimoradas estabelecendo este procedimento cirúrgico padrão.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos à Unidade de Medicina Animal Laboratorial da Universidade de Michigan por sua ajuda na alimentação e reprodução de animais. Este estudo é apoiado por NIH RO1 HL138139, NIH RO1 HL153710 para J. Zhang, NIH RO109946, RO1 HL134569 para Y.E. Chen, e a American Heart Association concede 20POST35110064 a G. Zhao.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 non-absorbable monofilament suture Pro Advantage P420697
Carprofen Zoetis Inc. NDC: 54771-8507
Chow Diet LabDiet 3005659-220 PicoLab 5L0D
Cotton Applicator Dynarex 4303
Cotton Pad Rael UPC: 810027130969
GraphPad Prism 8 GraphPad Software Inc. Version 8.4.3
Grarfe Forceps Fine Science Tools 11051-10
Halsted Mosquito Hemostats Fine Science Tools 13009-12
Ketamine Par Pharmaceutical NDC: 42023-0115-10
Nitrile gloves Fisherbrand 19-130-1597
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122
Porcine pancreatic elastase Sigma-Aldrich E1250-100MG
Scissors Fine Science Tools 14068-12
Sterile 0.9% saline solution Baxter 2B1324X
Xylazine Akorn NDC: 59399-110-20

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References

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