Summary

Größenausschlusschromatographie zur Trennung extrazellulärer Vesikel aus konditionierten Zellkulturmedien

Published: May 13, 2022
doi:

Summary

Das Protokoll zeigt hier, dass extrazelluläre Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie adäquat von konditionierten Zellkulturmedien getrennt werden können.

Abstract

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind lipidmembrangebundene Strukturen in Nanogröße, die von allen Zellen freigesetzt werden, in allen Bioflüssigkeiten vorhanden sind und Proteine, Nukleinsäuren und Lipide enthalten, die die Mutterzelle widerspiegeln, von der sie abgeleitet sind. Die richtige Trennung von EVs von anderen Komponenten in einer Probe ermöglicht die Charakterisierung ihrer zugehörigen Fracht und gibt Einblick in ihr Potenzial als interzelluläre Kommunikatoren und nicht-invasive Biomarker für zahlreiche Krankheiten. In der aktuellen Studie wurden aus Oligodendrozyten gewonnene EVs aus Zellkulturmedien isoliert, wobei eine Kombination modernster Techniken, einschließlich Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie (SEC), verwendet wurde, um EVs von anderen extrazellulären Proteinen und Proteinkomplexen zu trennen. Unter Verwendung kommerziell erhältlicher SEC-Säulen wurden EVs von extrazellulären Proteinen getrennt, die aus menschlichen Oligodendrogliom-Zellen sowohl unter Kontroll- als auch unter endoplasmatischem Retikulum (ER) -Stressbedingungen freigesetzt wurden. Die kanonischen EV-Marker CD9, CD63 und CD81 wurden in den Fraktionen 1-4 beobachtet, nicht jedoch in den Fraktionen 5-8. GM130, ein Protein des Golgi-Apparates, und Calnexin, ein integrales Protein des ER, wurden als negative EV-Marker verwendet und in keiner Fraktion beobachtet. Ferner wurde beim Pooling und der Konzentration der Fraktionen 1-4 als EV-Fraktion und der Fraktionen 5-8 als Proteinfraktion die Expression von CD63, CD81 und CD9 in der EV-Fraktion beobachtet. Die Expression von GM130 oder Calnexin wurde bei keinem der Fraktionstypen beobachtet. Die gepoolten Fraktionen sowohl aus Kontroll- als auch aus ER-Stressbedingungen wurden mit Transmissionselektronenmikroskopie visualisiert und Vesikel wurden in den EV-Fraktionen, aber nicht in den Proteinfraktionen beobachtet. Partikel in den EV- und Proteinfraktionen aus beiden Bedingungen wurden ebenfalls mit einer Nanopartikel-Tracking-Analyse quantifiziert. Zusammen zeigen diese Daten, dass SEC eine effektive Methode zur Trennung von EVs aus konditionierten Zellkulturmedien ist.

Introduction

Die Explosion des Interesses an der Untersuchung extrazellulärer Vesikel (EVs) wurde von großen Fortschritten in den Technologien und Techniken begleitet, die zur Trennung und Untersuchung dieser nanogroßen, heterogenen Partikel verwendet werden. In der Zeit seit ihrer Entdeckung vor fast vier Jahrzehnten1,2 wurde festgestellt, dass diese kleinen membranösen Strukturen bioaktive Lipide, Nukleinsäuren und Proteine enthalten und eine wichtige Rolle in der interzellulären Kommunikation spielen 3,4. EVs werden von allen Zelltypen freigesetzt und sind daher in allen biologischen Flüssigkeiten vorhanden, einschließlich Blutplasma und Serum, Speichel und Urin. EVs in diesen Flüssigkeiten sind vielversprechend, um als nicht-invasive Biomarker für verschiedene Krankheiten zu dienen, einschließlich neuroinflammatorischer und neurodegenerativer Erkrankungen, Krebs und Autoimmunerkrankungen 5,6,7. Ferner können mechanistische In-vitro-Studien durch Zellkulturtechniken durchgeführt werden, indem in das Kulturmedium 3,8,9 freigesetzte EVs getrennt werden.

Um die Rolle von EVs in der Krankheitspathophysiologie zu verstehen, ist eine angemessene Trennung von der Flüssigkeit, in der sie gefunden werden, von größter Bedeutung. Der Goldstandard für die EV-Trennung ist seit langem die differentielle Ultrazentrifugation (dUC)10, jedoch sind ausgefeiltere Techniken entstanden, um eine bessere Trennung von EVs von anderen extrazellulären Komponenten zu erreichen. Einige dieser Techniken umfassen Dichtegradienten, asymmetrische Flussfeldflussfraktion (A4F), Durchflusszytometrie, Immuneinfang, Polyethylenglykolfällung und Größenausschlusschromatographie (SEC) 11,12,13. Jede Technik hat ihre eigenen Vor- und Nachteile; Es wurde jedoch gezeigt, dass insbesondere SEC EVs sowohl von biologischen Flüssigkeiten als auch von Zellkulturüberständen recht effektiv trennt 8,14,15. SEC hat auch den zusätzlichen Vorteil, relativ einfach und benutzerfreundlich zu sein.

SEC ist eine Methode, die Komponenten einer Flüssigkeit basierend auf der Größe trennt. Bei dieser Technik wird eine Harzsäule (entweder intern hergestellt oder kommerziell gekauft) verwendet, um eine Probe zu fraktionieren. Kleine Partikel in der Probe werden zwischen den Perlen im Harz eingeschlossen, während größere Partikel das Harz freier passieren und somit früher im Prozess eluieren können. Da EVs größer sind als viele extrazelluläre Proteine und Proteinaggregate, passieren EVs die Säule schneller und eluieren in früheren Fraktionen als extrazelluläre Proteine14.

In diesem Methodenpapier wird die Verwendung von SEC zur Trennung von EVs aus Zellkulturmedien (CCM) aus menschlichen Oligodendrozyten sowohl unter Kontroll- als auch unter endoplasmatischem Retikulum (ER) Stressbedingungen skizziert. Unter Verwendung dieses Protokolls wird gezeigt, dass EVs, die mit dieser Technik getrennt werden, in bestimmten Fraktionen gefunden werden, die für die nachgeschaltete Charakterisierung zusammengefasst und konzentriert werden können, und dass die getrennten EVs aus Zellen stammen und nicht aus einer exogenen Quelle wie fetalem Rinderserum (FBS), das zur Ergänzung des CCM verwendet wird. Das Vorhandensein der kanonischen EV-Marker CD63, CD81 und CD916,17,18,19 in den EV-Fraktionen und ihre Abwesenheit in den Proteinfraktionen wird mit Western Blotting nachgewiesen. Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) werden EVs sichtbar gemacht und zeigen die erwartete Morphologie und werden nur in der EV-Fraktion beobachtet. Partikel werden auch in den EV- und Proteinfraktionen sowohl der Kontroll- als auch der ER-Stressbedingungen gezählt, und eine große Anzahl von Partikeln innerhalb des erwarteten Größenbereichs von 50-200 nm Durchmesser wird in den EV-Proben beobachtet. Zusammen unterstützen diese Daten die Vorstellung, dass SEC eine effiziente und effektive Methode zur Trennung von EVs aus Zellkulturmedien ist.

Protocol

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien HINWEIS: Stellen Sie Zellkulturreagenzien in Zellkulturhauben her, um die Sterilität zu erhalten. Herstellung von ZellkulturreagenzienBereiten Sie normales DMEM mit hohem Glukosegehalt zu, indem Sie 50 ml FBS und 5 ml Penicillin-Streptokokken (Pen-Streptokokken) in 500 ml DMEM mit hohem Glukosegehalt geben und bei 4 °C lagern. Verwenden Sie dieses Medium zum Kultivieren und Expandieren von Zellen. Exosom…

Representative Results

Western Blotting zeigt ausreichende Trennung von Elektrofahrzeugen von CCMUm die Wirksamkeit von SEC bei der Trennung von EVs aus Zellkulturmedien zu bewerten, wurde ein Western Blot unter Verwendung jeder einzelnen Fraktion aus den Kontrollproben durchgeführt, um die Expression der drei kanonischen EV-Marker CD9, CD63 und CD81 sowie GM130 und Calnexin18 zu untersuchen, die als Negativkontrollen verwendet wurden (Abbildung 3). Die Albuminexpressi…

Discussion

SEC ist eine benutzerfreundliche Methode zur adäquaten Trennung von Elektrofahrzeugen von konditioniertem CCM. Um zellabgeleitete EVs spezifisch zu isolieren, muss eine sorgfältige Berücksichtigung der Art des CCM und seiner Ergänzungen berücksichtigt werden. Viele Zellkulturmedien müssen mit FBS ergänzt werden, das EVs enthält, die von dem Tier stammen, bei dem das Serum geerntet wurde. Diese Serum-EVs können jedes Signal sättigen und maskieren, das von EVs erzeugt wird, die von Zellen in Kultur<sup class="xre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Penn State Behrend und der Hamot Health Foundation für die Finanzierung sowie der Penn State Microscopy Facility in University Park, PA.

Materials

2-Mercaptoethanol VWR 97064-588
4X Laemmli Sample Buffer BioRad 1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL Sigma-Aldrich UFC900308 3 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane Sigma-Aldrich UFC200324 3 kDa cutoff
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody Cell Signaling Technology 7074V 1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibody Abcam  ab22595 1:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody BioLegend 312102 1:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker Abcam ab52649 1:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076V 1:1000 Dilution
Automatic Fraction Collector Izon Science
BCA assay Kit Bio-Rad
CCD camera Gatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti Human BD 556019 1:1000 Dilution
CD81 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-23962 1:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks Greiner Bio-One 660175
ChemiDoc MP Imager BioRad
Clarity Western ECL Substrate BioRad 1705061
deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
dithiothreitol Sigma 3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium Cytiva SH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium grade VWR 97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depleted Thermo Scientific A2720801
Glycine BioRad 1610718
Great Value Nonfat Dry Milk Amazon B076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell Line Sigma-Aldrich SCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk Izon Science
Methanol >99.8% ACS VWR BDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass plates BioRad 1653310 with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short plates BioRad 1653308
NP-40 Sigma-Aldrich 492016
Penicillin-Streptomycin,Solution Sigma-Aldrich P4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBS Fisher Scientific BP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents Thermo Fisher Scientific 23227
Pierce PVDF Transfer Membranes Thermo Scientific 88518
Pierce Western Blotting Filter Paper Thermo Scientific 84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL Bio Basic TB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Cell Signaling Technology 5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] ABCam ab125011 1:1000 dilution
Slodium hydroxide Sigma-Aldrich SX0603
Sodium azide Fisher Scientific BP922I-500
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets Sigma-Aldrich 75746-1KG
Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% BioRad 1610183
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai 12 Biotwin
Tris BioRad 1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium Cytiva SH30042.01
Tunicamycin Tocris 3516
Zeta View software Analytik NTA software

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Cite This Article
Jones, M. T., Manioci, S. W., Russell, A. E. Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media. J. Vis. Exp. (183), e63614, doi:10.3791/63614 (2022).

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