Cromatografia ad esclusione dimensionale per separare le vescicole extracellulari dai terreni di coltura cellulare condizionati
Summary
Il protocollo qui dimostra che le vescicole extracellulari possono essere adeguatamente separate dai terreni di coltura cellulare condizionati utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale.
Abstract
Le vescicole extracellulari (EV) sono strutture legate alla membrana lipidica di dimensioni nanometriche che vengono rilasciate da tutte le cellule, sono presenti in tutti i biofluidi e contengono proteine, acidi nucleici e lipidi che riflettono la cellula madre da cui derivano. La corretta separazione degli EV dagli altri componenti in un campione consente la caratterizzazione del loro carico associato e fornisce informazioni sul loro potenziale come comunicatori intercellulari e biomarcatori non invasivi per numerose malattie. Nel presente studio, le EV derivate dagli oligodendrociti sono state isolate dai terreni di coltura cellulare utilizzando una combinazione di tecniche all’avanguardia, tra cui l’ultrafiltrazione e la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) per separare le EV da altre proteine extracellulari e complessi proteici. Utilizzando colonne SEC disponibili in commercio, le EV sono state separate dalle proteine extracellulari rilasciate dalle cellule di oligodendroglioma umano sia in condizioni di controllo che di stress del reticolo endoplasmatico (ER). I marcatori EV canonici CD9, CD63 e CD81 sono stati osservati nelle frazioni 1-4, ma non nelle frazioni 5-8. GM130, una proteina dell’apparato di Golgi, e calnexina, una proteina integrale dell’ER, sono stati usati come marcatori EV negativi e non sono stati osservati in nessuna frazione. Inoltre, quando si raggruppano e si concentrano le frazioni 1-4 come frazione EV e le frazioni 5-8 come frazione proteica, è stata osservata l’espressione di CD63, CD81 e CD9 nella frazione EV. L’espressione di GM130 o calnexina non è stata osservata in nessuno dei tipi di frazione. Le frazioni aggregate da entrambe le condizioni di stress di controllo e ER sono state visualizzate con microscopia elettronica a trasmissione e le vescicole sono state osservate nelle frazioni EV, ma non nelle frazioni proteiche. Anche le particelle nell’EV e le frazioni proteiche di entrambe le condizioni sono state quantificate con l’analisi del tracciamento delle nanoparticelle. Insieme, questi dati dimostrano che SEC è un metodo efficace per separare le EV dai terreni di coltura cellulare condizionati.
Introduction
L’esplosione di interesse nello studio delle vescicole extracellulari (EV) è stata accompagnata da importanti progressi nelle tecnologie e nelle tecniche utilizzate per separare e studiare queste particelle eterogenee di dimensioni nanometriche. Nel tempo trascorso dalla loro scoperta quasi quattro decenni fa1,2, queste piccole strutture membranose sono state trovate per contenere lipidi bioattivi, acidi nucleici e proteine, e svolgono un ruolo importante nella comunicazione intercellulare 3,4. Le EV vengono rilasciate da tutti i tipi di cellule e sono quindi presenti in tutti i fluidi biologici, compresi plasma sanguigno e siero, saliva e urina. Le EV all’interno di questi fluidi sono molto promettenti per servire come biomarcatori non invasivi per varie malattie, tra cui malattie neuroinfiammatorie e neurodegenerative, tumori e disturbi autoimmuni 5,6,7. Inoltre, gli studi meccanicistici in vitro possono essere eseguiti attraverso tecniche di coltura cellulare separando le EV rilasciate nel terreno di coltura 3,8,9.
Per comprendere il ruolo delle EV nella fisiopatologia della malattia, un’adeguata separazione dal fluido in cui si trovano è fondamentale. Il gold standard per la separazione delle EV è stato a lungo l’ultracentrifugazione differenziale (dUC)10, tuttavia sono emerse tecniche più sofisticate per ottenere una migliore separazione delle EV da altri componenti extracellulari. Alcune di queste tecniche includono gradienti di densità, frazione di flusso asimmetrico (A4F), citometria a flusso, immunocattura, precipitazione di polietilenglicole e cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) 11,12,13. Ogni tecnica ha il suo insieme di vantaggi e svantaggi; tuttavia, la SEC in particolare ha dimostrato di separare gli EV sia dai fluidi biologici che dai supernatanti di coltura cellulare in modo abbastanza efficace 8,14,15. SEC ha anche il vantaggio di essere relativamente semplice e facile da usare.
SEC è un metodo che separa i componenti di un fluido in base alle dimensioni. Con questa tecnica, una colonna di resina (prodotta internamente o acquistata commercialmente) viene utilizzata per frazionare un campione. Le particelle piccole nel campione rimangono intrappolate tra le perle all’interno della resina, mentre le particelle più grandi sono in grado di passare attraverso la resina più liberamente, e quindi eluire all’inizio del processo. Poiché le EV sono di dimensioni maggiori rispetto a molte proteine extracellulari e aggregati proteici, le EV passano attraverso la colonna più velocemente e si eluiscono nelle frazioni precedenti rispetto alle proteine extracellulari14.
In questo documento sui metodi, viene delineato l’uso di SEC per la separazione di EV da terreni di coltura cellulare (CCM) da oligodendrociti umani in condizioni di stress sia di controllo che del reticolo endoplasmatico (ER). Utilizzando questo protocollo, è dimostrato che le EV separate con questa tecnica si trovano all’interno di frazioni specifiche che possono essere raggruppate insieme e concentrate per la caratterizzazione a valle, e che le EV separate derivano da cellule e non da una fonte esogena come il siero bovino fetale (FBS) utilizzato per integrare il CCM. La presenza dei marcatori EV canonici, CD63, CD81 e CD916,17,18,19 nelle frazioni EV e la loro assenza nelle frazioni proteiche è dimostrata con western blotting. Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), le EV vengono visualizzate e visualizzano la morfologia attesa e vengono osservate solo nella frazione EV. Le particelle vengono anche contate nelle frazioni EV e proteiche di entrambe le condizioni di stress di controllo e ER, e un gran numero di particelle all’interno dell’intervallo di dimensioni previsto di 50-200 nm di diametro sono osservati nei campioni EV. Insieme, questi dati supportano l’idea che SEC sia un metodo efficiente ed efficace per separare le EV dai terreni di coltura cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
SEC è un metodo intuitivo per separare adeguatamente i veicoli elettrici dal CCM condizionato. Al fine di isolare specificamente le EV derivate da cellule, deve essere presa in considerazione un’attenta considerazione del tipo di CCM e dei suoi integratori. Molti terreni di coltura cellulare devono essere integrati con FBS, che contiene EV derivate dall’animale in cui è stato raccolto il siero. Queste EV sieriche possono saturare e mascherare qualsiasi segnale prodotto da EV derivate da cellule in coltura<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare la Penn State Behrend e la Hamot Health Foundation per i finanziamenti, nonché la Penn State Microscopy Facility di University Park, PA.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 97064-588 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610747 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL | Sigma-Aldrich | UFC900308 | 3 kDa cutoff |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Sigma-Aldrich | UFC200324 | 3 kDa cutoff |
| Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074V | 1:1000 Dilution |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab22595 | 1:500 Dilution |
| Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody | BioLegend | 312102 | 1:500 Dilution |
| Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker | Abcam | ab52649 | 1:500 Dilution |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076V | 1:1000 Dilution |
| Automatic Fraction Collector | Izon Science | ||
| BCA assay Kit | Bio-Rad | ||
| CCD camera | Gatan Orius SC200 | ||
| Cd63 Mouse anti Human | BD | 556019 | 1:1000 Dilution |
| CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23962 | 1:1000 Dilution |
| Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks | Greiner Bio-One | 660175 | |
| ChemiDoc MP Imager | BioRad | ||
| Clarity Western ECL Substrate | BioRad | 1705061 | |
| deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| dithiothreitol | Sigma | 3483-12-3 | |
| DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium | Cytiva | SH300022.FS | |
| Fetal Bovine Serum Premium grade | VWR | 97068-085 | |
| Fetal Bovine Serum, exosome-depleted | Thermo Scientific | A2720801 | |
| Glycine | BioRad | 1610718 | |
| Great Value Nonfat Dry Milk | Amazon | B076NRD2TZ | |
| HOG Human Oligodendroglioma Cell Line | Sigma-Aldrich | SCC163 | |
| Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk | Izon Science | ||
| Methanol >99.8% ACS | VWR | BDH1135-4LP | |
| Mini-PROTEAN Glass plates | BioRad | 1653310 | with 0.75mm spacers |
| Mini-PROTEAN Short plates | BioRad | 1653308 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 492016 | |
| Penicillin-Streptomycin,Solution | Sigma-Aldrich | P4458-100mL | |
| Phosphate Buffered Saline PBS | Fisher Scientific | BP66150 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce PVDF Transfer Membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Pierce Western Blotting Filter Paper | Thermo Scientific | 84783 | |
| Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL | Bio Basic | TB0560 | |
| Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Cell Signaling Technology | 5872S | |
| Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] | ABCam | ab125011 | 1:1000 dilution |
| Slodium hydroxide | Sigma-Aldrich | SX0603 | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets | Sigma-Aldrich | 75746-1KG | |
| Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% | BioRad | 1610183 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI Tecnai 12 Biotwin | ||
| Tris | BioRad | 1610716 | |
| Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium | Cytiva | SH30042.01 | |
| Tunicamycin | Tocris | 3516 | |
| Zeta View software | Analytik | NTA software |
References
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