Эксклюзионная хроматография для отделения внеклеточных везикул от кондиционированных клеточных культуральных сред
Summary
Протокол здесь демонстрирует, что внеклеточные везикулы могут быть адекватно отделены от обусловленных клеточных культуральных сред с помощью размерной эксклюзионной хроматографии.
Abstract
Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой наноразмерные липидно-мембранные связанные структуры, которые высвобождаются из всех клеток, присутствуют во всех биожидкостях и содержат белки, нуклеиновые кислоты и липиды, которые отражают родительскую клетку, из которой они получены. Правильное отделение EV от других компонентов в образце позволяет характеризовать связанный с ними груз и дает представление об их потенциале в качестве межклеточных коммуникаторов и неинвазивных биомаркеров для многочисленных заболеваний. В текущем исследовании oligodendrocyte derived EV были выделены из среды клеточной культуры с использованием комбинации современных методов, включая ультрафильтрацию и хроматографию исключения размера (SEC) для отделения EV от других внеклеточных белков и белковых комплексов. Используя коммерчески доступные колонки SEC, EV были отделены от внеклеточных белков, высвобождаемых из клеток олигодендроглиомы человека как под контролем, так и при стрессовых условиях эндоплазматического ретикулума (ER). Канонические EV-маркеры CD9, CD63 и CD81 наблюдались во фракциях 1-4, но не во фракциях 5-8. GM130, белок аппарата Гольджи, и кальнексин, интегральный белок ER, использовались в качестве отрицательных маркеров EV и не наблюдались ни в одной фракции. Далее, при объединении и концентрировании фракций 1-4 в качестве фракции EV и фракций 5-8 в качестве белковой фракции наблюдалась экспрессия CD63, CD81 и CD9 в фракции EV. Экспрессия GM130 или кальнексина не наблюдалась ни в одном из типов фракций. Объединенные фракции как из контрольных, так и из ER-стрессовых состояний были визуализированы с помощью просвечивающей электронной микроскопии, и везикулы наблюдались в фракциях EV, но не в белковых фракциях. Частицы в EV и белковых фракциях из обоих состояний также были количественно определены с помощью анализа отслеживания наночастиц. Вместе эти данные демонстрируют, что SEC является эффективным методом отделения EV от условных клеточных культур.
Introduction
Взрыв интереса к изучению внеклеточных везикул (EV) сопровождался значительными достижениями в технологиях и методах, используемых для разделения и изучения этих наноразмерных гетерогенных частиц. За время, прошедшее с момента их открытия почти четыре десятилетия назад 1,2, было обнаружено, что эти небольшие мембранные структуры содержат биологически активные липиды, нуклеиновые кислоты и белки и играют важную роль в межклеточной коммуникации 3,4. EV высвобождаются из всех типов клеток и, следовательно, присутствуют во всех биологических жидкостях, включая плазму крови и сыворотку, слюну и мочу. Ev в этих жидкостях имеют большие перспективы служить неинвазивными биомаркерами для различных заболеваний, включая нейровоспалительные и нейродегенеративные заболевания, рак и аутоиммунные расстройства 5,6,7. Кроме того, механистические исследования in vitro могут быть выполнены с помощью методов клеточной культуры путем разделения EV, высвобождаемых вкультуральную среду 3,8,9.
Чтобы понять роль EV в патофизиологии заболеваний, адекватное отделение от жидкости, в которой они находятся, имеет первостепенное значение. Золотым стандартом для разделения электромобилей уже давно является дифференциальное ультрацентрифугирование (dUC)10, однако возникли более сложные методы для достижения лучшего отделения EV от других внеклеточных компонентов. Некоторые из этих методов включают градиенты плотности, асимметрично-поточную полевую фракцию потока (A4F), проточную цитометрию, иммунозахват, осаждение полиэтиленгликоля и хроматографию с исключением размеров (SEC)11,12,13. Каждая методика имеет свой набор преимуществ и недостатков; тем не менее, было показано, что SEC, в частности, отделяет EV как от биологических жидкостей, так и от супернатантов клеточных культур довольно эффективно 8,14,15. SEC также имеет дополнительный бонус в том, что он относительно прост и удобен для пользователя.
SEC – это метод, который разделяет компоненты жидкости на основе размера. С помощью этого метода столб смолы (либо изготовленный собственными силами, либо приобретенный на коммерческой основе) используется для фракционирования образца. Мелкие частицы в образце попадают в ловушку между шариками внутри смолы, в то время как более крупные частицы способны проходить через смолу более свободно и, таким образом, элюироваться раньше в процессе. Поскольку EV больше по размеру, чем многие внеклеточные белки и белковые агрегаты, EV проходят через столб быстрее и элюируются в более ранних фракциях, чем внеклеточные белки14.
В данной работе по методам изложено использование SEC для отделения EV от клеточных культуральных сред (CCM) от олигодендроцитов человека как под контролем, так и в условиях стресса эндоплазматического ретикулума (ER). Используя этот протокол, показано, что EV, разделенные с помощью этого метода, обнаруживаются в определенных фракциях, которые могут быть объединены вместе и сконцентрированы для последующей характеристики, и что разделенные EV получены из клеток, а не из экзогенного источника, такого как фетальная бычья сыворотка (FBS), используемая для дополнения CCM. Наличие канонических ev-маркеров CD63, CD81 и CD9 16,17,18,19 в фракциях EV и их отсутствие в белковых фракциях демонстрируется при вестерн-блоттинге. Используя просвечивающую электронную микроскопию (ТЭМ), EV визуализируются и отображают ожидаемую морфологию и наблюдаются только в фракции EV. Частицы также подсчитываются в EV и белковых фракциях как контрольных, так и ER-стрессовых условий, а в образцах EV наблюдается большое количество частиц в пределах ожидаемого диапазона размеров 50-200 нм в диаметре. Вместе эти данные подтверждают представление о том, что SEC является эффективным и действенным методом отделения EV от сред клеточных культур.
Protocol
Representative Results
Discussion
SEC – это удобный для пользователя метод адекватного отделения электромобилей от кондиционированного CCM. Чтобы конкретно изолировать ЭВ, полученные из клеток, необходимо тщательно учитывать тип СКК и его добавок. Многие среды клеточных культур должны быть дополнены FBS, который содержит E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Penn State Behrend и Hamot Health Foundation за финансирование, а также Центр микроскопии штата Пенсильвания в Университетском парке, штат Пенсильвания.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 97064-588 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610747 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL | Sigma-Aldrich | UFC900308 | 3 kDa cutoff |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Sigma-Aldrich | UFC200324 | 3 kDa cutoff |
| Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074V | 1:1000 Dilution |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab22595 | 1:500 Dilution |
| Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody | BioLegend | 312102 | 1:500 Dilution |
| Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker | Abcam | ab52649 | 1:500 Dilution |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076V | 1:1000 Dilution |
| Automatic Fraction Collector | Izon Science | ||
| BCA assay Kit | Bio-Rad | ||
| CCD camera | Gatan Orius SC200 | ||
| Cd63 Mouse anti Human | BD | 556019 | 1:1000 Dilution |
| CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23962 | 1:1000 Dilution |
| Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks | Greiner Bio-One | 660175 | |
| ChemiDoc MP Imager | BioRad | ||
| Clarity Western ECL Substrate | BioRad | 1705061 | |
| deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| dithiothreitol | Sigma | 3483-12-3 | |
| DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium | Cytiva | SH300022.FS | |
| Fetal Bovine Serum Premium grade | VWR | 97068-085 | |
| Fetal Bovine Serum, exosome-depleted | Thermo Scientific | A2720801 | |
| Glycine | BioRad | 1610718 | |
| Great Value Nonfat Dry Milk | Amazon | B076NRD2TZ | |
| HOG Human Oligodendroglioma Cell Line | Sigma-Aldrich | SCC163 | |
| Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk | Izon Science | ||
| Methanol >99.8% ACS | VWR | BDH1135-4LP | |
| Mini-PROTEAN Glass plates | BioRad | 1653310 | with 0.75mm spacers |
| Mini-PROTEAN Short plates | BioRad | 1653308 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 492016 | |
| Penicillin-Streptomycin,Solution | Sigma-Aldrich | P4458-100mL | |
| Phosphate Buffered Saline PBS | Fisher Scientific | BP66150 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce PVDF Transfer Membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Pierce Western Blotting Filter Paper | Thermo Scientific | 84783 | |
| Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL | Bio Basic | TB0560 | |
| Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Cell Signaling Technology | 5872S | |
| Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] | ABCam | ab125011 | 1:1000 dilution |
| Slodium hydroxide | Sigma-Aldrich | SX0603 | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets | Sigma-Aldrich | 75746-1KG | |
| Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% | BioRad | 1610183 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI Tecnai 12 Biotwin | ||
| Tris | BioRad | 1610716 | |
| Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium | Cytiva | SH30042.01 | |
| Tunicamycin | Tocris | 3516 | |
| Zeta View software | Analytik | NTA software |
References
- Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
- Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
- Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14 (2018).
- Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
- O’Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651 (2022).
- Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
- Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
- Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211 (2021).
- Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773 (2021).
- Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles’ characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
- Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).
- Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
- Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145 (2021).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239 (2007).
- Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450 (2020).
- Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276 (2018).
- Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479 (2018).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
