Størrelseseksklusjonskromatografi for separering av ekstracellulære vesikler fra betingede cellekulturmedier

Summary

Protokollen her viser at ekstracellulære vesikler kan skilles tilstrekkelig fra betingede cellekulturmedier ved bruk av størrelseseksklusjonskromatografi.

Abstract

Ekstracellulære vesikler (EV) er nano-størrelse lipidmembranbundne strukturer som frigjøres fra alle celler, er tilstede i alle biofluider, og inneholder proteiner, nukleinsyrer og lipider som reflekterer foreldrecellen som de er avledet fra. Riktig separasjon av elbiler fra andre komponenter i en prøve muliggjør karakterisering av tilhørende last og gir innsikt i deres potensial som intercellulære kommunikatorer og ikke-invasive biomarkører for mange sykdommer. I den nåværende studien ble oligodendrocytterte elbiler isolert fra cellekulturmedier ved hjelp av en kombinasjon av toppmoderne teknikker, inkludert ultrafiltrering og størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) for å skille elbiler fra andre ekstracellulære proteiner og proteinkomplekser. Ved hjelp av kommersielt tilgjengelige SEC-kolonner ble EV skilt fra ekstracellulære proteiner frigjort fra humane oligodendrogliomceller under både kontroll og endoplasmatisk retikulum (ER) stressforhold. De kanoniske EV-markørene CD9, CD63 og CD81 ble observert i fraksjonene 1-4, men ikke i fraksjonene 5-8. GM130, et protein i Golgi-apparatet, og calnexin, et integrert protein av ER, ble brukt som negative EV-markører, og ble ikke observert i noen fraksjon. Videre, ved sammenslåing og konsentrasjon av fraksjonene 1-4 som EV-fraksjonen, og fraksjonene 5-8 som proteinfraksjonen, ble ekspresjon av CD63, CD81 og CD9 i EV-fraksjonen observert. Ekspresjonen av GM130 eller kalnexin ble ikke observert i noen av fraksjonstypene. De samlede fraksjonene fra både kontroll- og ER-stressforhold ble visualisert med transmisjonselektronmikroskopi og vesikler ble observert i EV-fraksjonene, men ikke i proteinfraksjonene. Partikler i EV og proteinfraksjoner fra begge forholdene ble også kvantifisert med nanopartikkelsporingsanalyse. Sammen viser disse dataene at SEC er en effektiv metode for å skille elbiler fra betingede cellekulturmedier.

Introduction

Eksplosjonen av interesse for å studere ekstracellulære vesikler (EV) har blitt ledsaget av store fremskritt i teknologiene og teknikkene som brukes til å skille og studere disse nanostore, heterogene partiklene. I tiden siden oppdagelsen for nesten fire tiår siden^1,2, har disse små membranøse strukturer blitt funnet å inneholde bioaktive lipider, nukleinsyrer og proteiner, og spiller store roller i intercellulær kommunikasjon ^3,4. Elbiler frigjøres fra alle celletyper og er derfor til stede i alle biologiske væsker, inkludert blodplasma og serum, spytt og urin. Elbiler i disse væskene har stort løfte om å tjene som ikke-invasive biomarkører for ulike sykdommer, inkludert nevroinflammatoriske og nevrodegenerative sykdommer, kreft og autoimmune lidelser ^5,6,7. Videre kan in vitro mekanistiske studier utføres gjennom cellekulturteknikker ved å separere elbiler som slippes ut i kulturmediet ^3,8,9.

For å forstå elbilers rolle i sykdomspatofysiologi, er tilstrekkelig separasjon fra væsken der de er funnet, avgjørende. Gullstandarden for EV-separasjon har lenge vært differensial ultracentrifugering (dUC)¹⁰, men mer sofistikerte teknikker har oppstått for å oppnå bedre separasjon av elbiler fra andre ekstracellulære komponenter. Noen av disse teknikkene inkluderer tetthetsgradienter, asymmetrisk strømningsfeltstrømningsfraksjon (A4F), flowcytometri, immunfangst, polyetylenglykolutfelling og størrelseseksklusjonskromatografi (SEC)^11,12,13. Hver teknikk har sitt eget sett med fordeler og ulemper; Imidlertid har SEC spesielt vist seg å skille elbiler fra både biologiske væsker og cellekultursupernatanter ganske effektivt 8,14,15. SEC har også den ekstra bonusen å være relativt grei og brukervennlig.

SEC er en metode som separerer komponenter av en væske basert på størrelse. Med denne teknikken brukes en kolonne av harpiks (enten laget internt eller kjøpt kommersielt) for å fraksjonere en prøve. Små partikler i prøven blir fanget mellom perlene i harpiksen, mens større partikler er i stand til å passere gjennom harpiksen mer fritt, og dermed eluere tidligere i prosessen. Fordi elbiler er større i størrelse enn mange ekstracellulære proteiner og proteinaggregater, passerer elbiler raskere gjennom kolonnen og eluerer i tidligere fraksjoner enn ekstracellulære proteiner¹⁴.

I dette metodepapiret skisseres bruken av SEC for separasjon av EV fra cellekulturmedier (CCM) fra humane oligodendrocytter under både kontroll og endoplasmatisk retikulum (ER) stressforhold. Ved hjelp av denne protokollen er det vist at elbiler separert med denne teknikken finnes innenfor spesifikke fraksjoner som kan samles sammen og konsentreres for nedstrøms karakterisering, og at de separerte elbilene er avledet fra celler og ikke fra en eksogen kilde som føtalt bovint serum (FBS) som brukes til å supplere CCM. Tilstedeværelsen av de kanoniske EV-markørene, CD63, CD81 og CD9^16,17,18,19 i EV-fraksjonene^, og deres fravær i proteinfraksjonene er demonstrert med vestlig blotting. Ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM) visualiseres EV og viser forventet morfologi og observeres bare i EV-fraksjonen. Partikler telles også i EV- og proteinfraksjonene av både kontroll- og ER-spenningsforhold, og et stort antall partikler innenfor det forventede størrelsesområdet 50-200 nm i diameter observeres i EV-prøvene. Sammen støtter disse dataene forestillingen om at SEC er en effektiv og effektiv metode for å skille elbiler fra cellekulturmedier.

Protocol

1. Fremstilling av buffere og reagenser MERK: Lag cellekulturreagenser i cellekulturhette for å opprettholde sterilitet. Fremstilling av cellekulturreagenserForbered normal DMEM med høy glukose ved å tilsette 50 ml FBS og 5 ml penicillin-streptokokker (Pen-Strep) i 500 ml DMEM med høy glukose og oppbevares ved 4 °C. Bruk dette mediet til dyrking og utvidelse av celler. Forbered eksosomutarmet DMEM med høy glukose ved å tilsette 50 ml eksoso…

Representative Results

Western blotting avslører tilstrekkelig separasjon av elbiler fra CCMFor å evaluere effektiviteten av SEC for å skille elbiler fra cellekulturmedier, ble det kjørt en western blot ved hjelp av hver enkelt fraksjon fra kontrollprøvene for å undersøke uttrykk for de tre kanoniske EV-markørene, CD9, CD63 og CD81, samt GM130 og calnexin18, som ble brukt som negative kontroller (figur 3). Albuminuttrykk18 ble også under…

Discussion

SEC er en brukervennlig metode for tilstrekkelig separering av elbiler fra betinget CCM. For å spesifikt isolere celleavledede elbiler, må det tas hensyn til typen CCM og dens kosttilskudd. Mange cellekulturmedier må suppleres med FBS, som inneholder elbiler avledet fra dyret der serumet ble høstet. Disse serum-EV-ene kan mette og maskere ethvert signal produsert av elbiler avledet fra celler i kultur²⁶. Derfor, når du utfører eksperimenter, bør EV-utarmet FBS brukes når det er mulig for ?…

Materials

2-Mercaptoethanol	VWR	97064-588
4X Laemmli Sample Buffer	BioRad	1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL	Sigma-Aldrich	UFC900308	3 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane	Sigma-Aldrich	UFC200324	3 kDa cutoff
Ammonium Persulfate	Sigma-Aldrich	A3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074V	1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibody	Abcam	ab22595	1:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody	BioLegend	312102	1:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker	Abcam	ab52649	1:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7076V	1:1000 Dilution
Automatic Fraction Collector	Izon Science
BCA assay Kit	Bio-Rad
CCD camera	Gatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti Human	BD	556019	1:1000 Dilution
CD81 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-23962	1:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks	Greiner Bio-One	660175
ChemiDoc MP Imager	BioRad
Clarity Western ECL Substrate	BioRad	1705061
deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
dithiothreitol	Sigma	3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium	Cytiva	SH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium grade	VWR	97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depleted	Thermo Scientific	A2720801
Glycine	BioRad	1610718
Great Value Nonfat Dry Milk	Amazon	B076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell Line	Sigma-Aldrich	SCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk	Izon Science
Methanol >99.8% ACS	VWR	BDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass plates	BioRad	1653310	with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short plates	BioRad	1653308
NP-40	Sigma-Aldrich	492016
Penicillin-Streptomycin,Solution	Sigma-Aldrich	P4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBS	Fisher Scientific	BP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents	Thermo Fisher Scientific	23227
Pierce PVDF Transfer Membranes	Thermo Scientific	88518
Pierce Western Blotting Filter Paper	Thermo Scientific	84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL	Bio Basic	TB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Cell Signaling Technology	5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]	ABCam	ab125011	1:1000 dilution
Slodium hydroxide	Sigma-Aldrich	SX0603
Sodium azide	Fisher Scientific	BP922I-500
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets	Sigma-Aldrich	75746-1KG
Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%	BioRad	1610183
Transmission Electron Microscope	FEI Tecnai 12 Biotwin
Tris	BioRad	1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium	Cytiva	SH30042.01
Tunicamycin	Tocris	3516
Zeta View software	Analytik		NTA software