슬개골 지방 패드 중간엽 줄기세포(IFP-MSC)는 무릎 관절의 슬개골하 지방 패드에서 쉽게 분리할 수 있습니다. 그들은 시험관 내에서 잘 증식하고 CFU-F 콜로니를 형성하며 지방 형성, 연골 형성 및 골 형성 계통으로 분화합니다. 본원에서, 염소 스티플 조인트로부터 IFP-MSC의 분리, 확장 및 분화를 위한 방법론이 제공된다.
무릎 관절에 존재하는 IFP는 MSC의 유망한 공급원 역할을합니다. IFP는 관절경 시술 및 무릎 교체 수술 중에 일상적으로 절제되고 폐기되기 때문에 쉽게 접근할 수 있는 조직입니다. 또한, 그 제거는 최소 기증자 부위 이환율과 관련이 있습니다. 최근 연구에 따르면 IFP-MSC는 시험관 내 확장 중에 증식 능력을 잃지 않으며 연령 독립적 인 골 형성 분화 잠재력을 가지고 있음이 입증되었습니다. IFP-MSC는 골수 유래 중간엽줄기세포(BMSC) 및 지방유래 줄기세포(ADSC)에 비해 우수한 연골성 분화 잠재력을 가지고 있습니다. 이러한 세포는 노화되고 병에 걸린 환자에게서 쉽게 얻을 수 있지만 그 효과는 제한적입니다. 따라서 건강한 기증자의 IFP-MSC를 사용하는 것은 생물 의학 응용 분야에서 효능을 결정하는 데 중요합니다. 건강한 인간 기증자에 대한 접근이 어렵 기 때문에 동물 모델은 근본적인 이해를 가능하게하는 더 나은 대안이 될 수 있습니다. 개, 말, 양, 염소와 같은 큰 동물은 중개 연구에서 중요한 역할을 합니다. 이 중 염소의 질식 관절이 인간의 무릎 관절에 가장 가까운 해부학을 가지고 있기 때문에 염소가 선호되는 모델이 될 수 있습니다. 또한 goat-IFP는 조직 재생 응용 분야에 필요한 더 높은 MSC 수치를 충족할 수 있습니다. 또한 저렴한 비용, 가용성 및 동물 연구를 위한 3R 원칙 준수로 인해 매력적인 모델입니다. 이 연구는 IFP-MSC를 염소의 질식 관절과 확장 및 분화를 위한 시험관 내 배양 조건에서 분리하기 위한 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 염소로부터 무균적으로 단리된 IFP를 세척하고, 다지고, 효소적으로 소화시켰다. 여과 및 원심분리 후, 수집된 세포를 배양하였다. 이 세포는 부착되었고 MSC와 유사한 형태를 가지고 있으며 놀라운 클론 생성 능력을 보여주었습니다. 또한, 그들은 지방 형성, 연골 형성 및 골 형성 계통으로 분화하여 다분화능을 입증했습니다. 결론적으로이 연구는 조직 공학 및 재생 의학 응용 분야에서 잠재력을 보여주는 MSC의 분리 및 확장을 보여줍니다.
중간엽 줄기세포(MSC)는 재생 의학 1,2에서 세포 기반 요법의 매력적인 후보입니다. 골수, 탯줄, 태반, 치수 및 피하 지방 조직과 같은 다양한 조직 공급원에서 수확 할 수 있습니다3. 그러나 성인에서 줄기 세포의 가용성이 제한적이고 분리 절차가 종종 침습적이기 때문에 (기증자 부위 이환율을 초래) 이러한 문제를 피할 수있는 대체 줄기 세포 공급원을 갖는 것이 바람직합니다.
무릎 관절은 슬개하부 지방 패드 유래 MSC, 활막 유래 MSC, 활액 유래 MSC, 인대 섬유아세포, 관절 연골세포 등다양한 세포 유형의 저장소입니다. 이 세포는 근골격계 조직 공학 기반 연구에서 널리 탐구 될 가능성이 있습니다. 따라서 무릎 관절은 여러 유형의 MSC의 가능하고 신뢰할 수있는 공급원이 될 수 있습니다. 슬개골 하 지방 패드 (IFP) 또는 Hoffa의 지방 패드로 알려진 무릎 관절에 위치한 지방 저장소는 MSC 저장소의 유망하고 대안적인 선택입니다. IFP는 무릎 관절경 검사 또는 개복 무릎 수술 중에 수술 폐기물로 일상적으로 절제되고 폐기되기 때문에 비교적 쉽게 접근 할 수 있고 임상 적으로 얻을 수있는 MSC 공급원입니다. IFP의 제거는 최소 기증자 부위 이환율과 관련이 있으며, 이는 또한 매력적인 조직 공급원이됩니다. 유사한 표현형 프로파일을 가지고 있지만, IFP의 MSC (IFP-MSCs)는 골수 유래 중간 엽 줄기 세포 (BM-MSC)와 비교할 때 클론 생성 잠재력이 향상되고 피하 지방 유래 줄기 세포 (ADSC)에 비해 더 나은 증식 능력을 가지고 있습니다 7. 흥미롭게도 활액 유래 MSC (SF-MSC)와 비교하여 IFP-MSC는 늦은 계대에서 증식 능력을 잃지 않으며 늦은 계대에서 배가 시간이 증가하지도 않습니다. 이는 세포 확장 동안, IFP-MSC가 이들의증식 속도(8)를 손상시키지 않으면서 시험관내 조직 공학 응용을 위해 충분히 많은 수의 세포를 달성할 수 있음을 시사한다. 최근 연구에 따르면 IFP-MSC는 골수 유래 MSC (BMSC) 및 지방 유래 MSC (ADSC)에 비해 우수한 연골 생성 분화 잠재력을 가지고 있으며, 이는 아마도 관절 연골에 대한 해부학 적 근접성으로 인해 연골 조직 공학에 대한 적합성을 나타냅니다 6,7,9,10. 또한, 그들은 또한 연령 독립적 인 골 형성 분화 잠재력을 가지고 있습니다11. IFP-MSC의 관절 내 주사는 골관절염 (OA) 환자의 통증을 줄이고 무릎 관절 기능을 향상시키는 것으로 나타났습니다12,13. 또한, 병리학 적 조건 동안 염증성 사이토 카인의 존재하에 IFP-MSC의 강력한 면역 억제 반응 및 개선 된 면역 조절 특성이보고되었다6.
IFP-MSC는 MSC의 유망하고 대체 소스입니다. 그러나 조직 공학 및 재생 의학에서의 치료 적 이점은 상대적으로 덜 탐구됩니다. IFP-MSC에 대한 기존 연구는 주로 인간 기증자의 세포를 활용했습니다. 이 중 최근 몇 가지 연구에서는 건강한 인간 기증자 (비 관절염 환자, 17-60 세)의 IFP-MSC를 조사한 반면,14 대부분의 연구에서는 무릎 교체 수술을받는 노인 환자 (질병 환자, 70-80 세)의 IFP-MSC를 사용했습니다. 나이와 질병 모두 줄기 세포의 정상적인 기능을 변화시키는 것으로 알려져 있기 때문에 (수 감소 및 기능적 잠재력 상실), 이는 잠재적으로 MSC 기반 연구 7,15,16,17의 결과에 불일치를 초래할 수 있습니다. 그 외에도 병태생리학적 상태(예: 관절염 및 비만)가 있는 환자의 IFP-MSC를 사용하면 시험관 내에서 건강한 세포의 기본 특성을 이해하는 데 어려움이 있어 중간엽수 기반 치료법 개발에 제한 요소로 작용합니다. 이러한 문제를 극복하기 위해서는 건강한 기증자의 IFP-MSC를 사용하는 것이 중요합니다. 건강한 인간 기증자에 대한 접근이 어렵 기 때문에 동물 모델이 더 나은 대안이 될 수 있습니다. 이와 관련하여 IFP가 마우스18에서 분리 된 몇 가지 연구가 있습니다. 그러나, 정상 마우스에서 지방 패드의 크기가 작기 때문에, 다수의 동물로부터의 지방 조직이 정교한 실험 절차(19)를 실행하기에 충분한 조직을 얻기 위해 결합되었다. 따라서, 더 많은 수의 세포에 대한 요구 사항을 충족시키고 동시에 동물 연구20에서 3R 원칙 (정제, 교체 및 감소)을 준수 할 수있는 대형 동물 모델이 필요합니다. 큰 동물의 사용은 중개 연구에서 중요한 의미를 갖는다. 특히, 근골격계 조직 공학에서는 개, 돼지, 양, 염소 및 말과 같은 다양한 대형 동물이 조사되었습니다21. 염소 (Capra aegagrus hircus)는 질식 관절이 인간의 무릎 관절22,23,24에 가장 가까운 해부학 적 구조를 가지고 있기 때문에 큰 동물의 탁월한 선택입니다. 염소의 연골하 골 섬유주 구조와 연골하 뼈 두께는 인간과 유사하며 연골과 뼈의 비율도 인간에 가까운 것으로 보고됩니다21. 또한 염소는 전 세계적으로 널리 길들여져 골격이 성숙했을 때 쉽게 구할 수 있습니다. 또한 유지 보수 비용이 낮고 취급이 용이하여 연구22에 매력적인 동물 모델이되었습니다.
본 연구에서, Capra aegagrus hircus (염소)의 질식 관절로부터 IFP-MSC를 분리하기위한 간단한 프로토콜과 이들의 확장 및 분화를위한 시험관 내 배양 조건이 입증된다. 분리된 세포는 부착되어 있고, MSC 유사 형태를 가지며, CFU-F(콜로니 형성 단위-섬유아세포) 콜로니를 형성하고, 지방형성, 연골성 및 골형성 분화 잠재력을 가지고 있습니다. 따라서 IFP-MSC는 생물 의학 응용 분야를위한 MSC의 대체 공급원으로서의 잠재력을 보여줍니다.
본 프로토콜에서, 염소 IFP로부터 MSC의 단리를 위한 간단하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 방법이 제공되었다. 이 방법을 사용하여 분리 된 세포는 시험관 내 조직 재생을위한 이전 연구에서 성공적으로 사용되었습니다. 단리된 세포는 증식하고, 다양한 성장 인자에 반응하며, 전기방사 섬유 및 스캐폴드25,26 상에 파종될 때 이들의 생물학적 활?…
The authors have nothing to disclose.
SH는 IIT Kanpur의 Institute Post-Doctoral Fellowship 및 DST (SEED Division) (SP / YO / 618 / 2018)의 SYST 보조금의 지원을 인정합니다. AM은 인도 공과 대학-칸푸르 (IIT-Kanpur)를 연구소 펠로우십으로 인정합니다. DSK는 Gireesh Jankinath 석좌 교수직 및 인도 생명 공학과에 자금 지원을 인정합니다 (BT / PR22445 / MED / 32 / 571 / 2016). AM, SH 및 DSK는 IIT-Kanpur의 의학 공학을위한 메타 가족 센터의 관대 한 지원에 감사드립니다.
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422-10G | 10 mM |
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA | Hi-Media | TCL049 | |
15-mL centrifuge tube | Corning | ||
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | 50 µg/mL |
2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | HiMedia | TCL021-50ml | 10 mM |
50-mL centrifuge tube | Corning | ||
Alcian Blue | Hi-Media | RM471 | For sufated gycosaminoglycans staining |
Alizarin Red S | S D Fine-Chem Limited | 26048-25G | For calcium deposition |
Amphotericin B | HiMedia | A011 | 2.5 µg/mL |
Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Sino Biologicals | 10014-HNAE | 5 ng/mL |
BCIP/NBT ALP Substrate | Sigma | B5655-5TAB | For ALP staining |
Biological safety cabinet | |||
BSA | HiMedia | MB-083 | Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL ) |
Cell strainer | HiMedia | TCP-182 | 70 µm |
Centrifuge | REMI | ||
Ciprofloxacin | RANBAXY LAB. Limited | B17407T1 | 2.5 µg/mL |
Crystal Violet | S D Fine-Chem Limited | 42555 | |
D(+)-glucose | Merck | 1.94925.0521 | 25 mM |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 µM |
DMEM LG | SIGMA | D5523 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose |
Ethanol | Merck | 100983 | |
FBS | Gibco | 10270 | Long name: Fetal Bovine Serum |
Formaldehyde solution 37%-41% | Merck | 61780805001730 | |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 µM |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | 10 µg/mL |
Inverted microscope | Nikon Eclipse TS 100 | ||
ITS + 1 | Sigma-Aldrich | I2521-5mL | Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA |
L-Proline | HiMedia | TO-109-25G | 1 mM |
Magnesium chloride | Merck | 61751605001730 | For lysis buffer |
Methanol | Meck | 1.07018.2521 | |
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Thermoscientific | ||
MUSE Cell analyser | Merck Millipore | For cell counting | |
OCT compound | Tissue-Tek | 4583 | Long name: Optimal Cutting Temperature |
Oil Red O dye | S D Fine-Chem Limited | 54304 | For lipid vacuole staining |
Penicillin-Streptomycin | HiMedia | A007 | 100 U/mL |
Petri dishes (150 mm and 90 mm) | NEST | ||
Safranin O | S D Fine-Chem Limited | 50240 | For sufated gycosaminoglycans staining |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C3434 | 3.4 % (w/v) |
Sterile scissors, forceps and scalpels | For isolation of IFP-MSC | ||
Sucrose | Merck | 1.94953.0521 | 35 % (w/v) |
TGF-β1 | Sino Biologicals | Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL) | |
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Thermoscientific | ||
Tris buffer | Merck | 61771405001730 | For lysis buffer |
Triton X100 | S D Fine-Chem Limited | 40632 | For lysis buffer |
Type II collagenase | Gibco | 17101015 | 1.5 mg/mL |
Vitamin D3 | Sigma | C9756-1G | 10 nM |
Well plates (6 -WP and 24-WP) | NEST |