Summary
Le cellule staminali mesenchimali infrarotulee (IFP-MSC) possono essere isolate facilmente dal cuscinetto adiposo infrarotuleo dell'articolazione del ginocchio. Proliferano bene in vitro, formano colonie CFU-F e si differenziano in linee adipogeniche, condrogeniche e osteogeniche. Qui viene fornita la metodologia per l'isolamento, l'espansione e la differenziazione delle IFP-MSC dall'articolazione del soffocamento della capra.
Abstract
L'IFP, presente nell'articolazione del ginocchio, funge da fonte promettente di MSC. L'IFP è un tessuto facilmente accessibile in quanto viene regolarmente resecato e scartato durante le procedure artroscopiche e gli interventi chirurgici di sostituzione del ginocchio. Inoltre, la sua rimozione è associata a una morbilità minima del sito donatore. Studi recenti hanno dimostrato che le IFP-MSC non perdono la loro capacità di proliferazione durante l'espansione in vitro e hanno un potenziale di differenziazione osteogenica indipendente dall'età. Le IFP-MSC possiedono un potenziale di differenziazione condrogena superiore rispetto alle MSC derivate dal midollo osseo (BMSC) e alle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC). Sebbene queste cellule siano facilmente ottenibili da pazienti anziani e malati, la loro efficacia è limitata. Pertanto, l'utilizzo di IFP-MSC da donatori sani è importante per determinare la loro efficacia nelle applicazioni biomediche. Poiché l'accesso a un donatore umano sano è difficile, i modelli animali potrebbero essere un'alternativa migliore per consentire la comprensione fondamentale. Grandi animali come cani, cavalli, pecore e capre svolgono un ruolo cruciale nella ricerca traslazionale. Tra questi, la capra potrebbe essere un modello preferito poiché l'articolazione soffocante della capra ha l'anatomia più vicina all'articolazione del ginocchio umano. Inoltre, l'IFP di capra può soddisfare i numeri MSC più elevati necessari per le applicazioni di rigenerazione dei tessuti. Inoltre, il basso costo, la disponibilità e la conformità ai principi 3R per la ricerca sugli animali li rendono un modello attraente. Questo studio dimostra un semplice protocollo per isolare le IFP-MSC dall'articolazione soffocante delle capre e dalle condizioni di coltura in vitro per la loro espansione e differenziazione. L'IFP asettico isolato dalla capra è stato lavato, tritato e digerito enzimaticamente. Dopo la filtrazione e la centrifugazione, le cellule raccolte sono state coltivate. Queste cellule erano aderenti, avevano una morfologia simile alle MSC e dimostravano una notevole capacità clonogenica. Inoltre, si sono differenziati in linee adipogeniche, condrogeniche e osteogeniche, dimostrando la loro multipotenza. In conclusione, lo studio dimostra l'isolamento e l'espansione delle MSC, che mostrano il potenziale nelle applicazioni di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa.
Introduction
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono un candidato interessante per le terapie cellulari nella medicina rigenerativa 1,2. Possono essere raccolti da una varietà di fonti tissutali come midollo osseo, cordone ombelicale, placenta, polpa dentale e tessuto adiposo sottocutaneo3. Tuttavia, poiché la disponibilità di cellule staminali negli adulti è limitata e la loro procedura di isolamento è spesso invasiva (con conseguente morbilità del sito donatore), è auspicabile avere una fonte alternativa di cellule staminali che potrebbe aggirare queste sfide.
L'articolazione del ginocchio è un deposito di vari tipi di cellule, come MSC derivate da cuscinetti di grasso infrarotuleo, MSC derivate dalla membrana sinoviale, MSC derivate dal liquido sinoviale, fibroblasti legamentosi, condrociti articolari, ecc 4,5,6. Queste cellule hanno il potenziale per essere ampiamente esplorate nella ricerca basata sull'ingegneria dei tessuti muscoloscheletrici. Pertanto, l'articolazione del ginocchio potrebbe essere una fonte possibile e affidabile di più tipi di MSC. Il deposito adiposo situato nell'articolazione del ginocchio, noto come cuscinetto adiposo infrarotuleo (IFP) o cuscinetto adiposo di Hoffa, è una scelta promettente e alternativa del deposito MSC. L'IFP è una fonte relativamente facilmente accessibile e clinicamente ottenibile di MSC, poiché viene regolarmente resecata e scartata come rifiuto chirurgico durante l'artroscopia del ginocchio o la chirurgia del ginocchio aperto. La rimozione dell'IFP è associata a una morbilità minima del sito donatore, che lo rende anche una fonte di tessuto attraente. Pur avendo un profilo fenotipico simile, le MSC da IFP (IFP-MSCs) hanno un potenziale clonogenico aumentato rispetto alle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BM-MSCs)6 e una migliore capacità proliferativa rispetto alle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo sottocutaneo (ADSC)7. È interessante notare che, rispetto alle MSC derivate dal liquido sinoviale (SF-MSCs), le IFP-MSC non perdono la loro capacità proliferativa nei passaggi tardivi, né il tempo di raddoppio aumenta nei passaggi tardivi. Ciò suggerisce che, durante l'espansione cellulare, le IFP-MSC possono raggiungere un numero sufficientemente elevato di cellule per applicazioni di ingegneria tissutale in vitro senza compromettere il loro tasso di proliferazione8. Studi recenti hanno anche suggerito che le IFP-MSC possiedono un potenziale di differenziazione condrogena superiore rispetto alle MSC derivate dal midollo osseo (BMSC) e alle MSC derivate dal tessuto adiposo (ADSC), probabilmente a causa della loro vicinanza anatomica alla cartilagine articolare, indicando la loro idoneità per l'ingegneria del tessuto cartilagineo 6,7,9,10. Inoltre, possiedono anche un potenziale di differenziazione osteogenica indipendente dall'età11. È stato dimostrato che l'iniezione intra-articolare di IFP-MSCs riduce il dolore e migliora le funzioni articolari del ginocchio nei pazienti con osteoartrite (OA)12,13. Inoltre, sono state riportate anche forti risposte immunosoppressive e migliori proprietà immunomodulatorie delle IFP-MSCs in presenza di citochine infiammatorie durante condizioni patologiche6.
Le IFP-MSC sono una fonte promettente e alternativa di MSC; Tuttavia, il loro beneficio terapeutico nell'ingegneria tissutale e nella medicina rigenerativa è relativamente meno esplorato. Gli studi esistenti sulle IFP-MSC hanno utilizzato principalmente cellule provenienti da donatori umani. Tra questi, alcuni studi recenti hanno indagato IFP-MSC da donatori umani sani (pazienti non artritici, di età compresa tra 17 e 60 anni)6,14, mentre la maggior parte degli studi ha utilizzato IFP-MSC di pazienti anziani sottoposti a chirurgia sostitutiva totale del ginocchio (pazienti malati, età 70-80 anni). Poiché sia l'età che la malattia sono note per alterare il normale funzionamento delle cellule staminali (numero ridotto e perdita di potenziale funzionale), ciò potrebbe potenzialmente portare a incongruenze nei risultati degli studi basati su MSC 7,15,16,17. Inoltre, l'uso di IFP-MSCs da pazienti con condizioni fisiopatologiche (ad esempio, artrite e obesità) pone anche difficoltà per la comprensione delle caratteristiche di base delle cellule sane in vitro, agendo così come fattore limitante nello sviluppo di terapie basate su MSC. Per superare questi problemi, l'uso di IFP-MSC da donatori sani è vitale. Poiché l'accesso a un donatore umano sano è impegnativo, i modelli animali potrebbero essere un'alternativa migliore. A questo proposito, ci sono alcuni studi in cui IFP è stato isolato dai topi18. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni del cuscinetto adiposo nei topi normali, i tessuti grassi di più animali sono stati combinati per ottenere abbastanza tessuto per eseguire elaborate procedure sperimentali19. Quindi, c'è bisogno di un modello animale di grandi dimensioni, che potrebbe soddisfare il requisito per il maggior numero di cellule e contemporaneamente rispettare i principi 3R (perfezionare, sostituire e ridurre) nella ricerca sugli animali20. L'uso di grandi animali ha implicazioni significative nella ricerca traslazionale. In particolare, nell'ingegneria dei tessuti muscoloscheletrici, è stata studiata una serie di animali di grandi dimensioni come cani, maiali, pecore, capre e cavalli21. La capra (Capra aegagrus hircus) è un'ottima scelta di animali di grandi dimensioni poiché la sua articolazione soffocante ha l'anatomia più vicina all'articolazione del ginocchio umano22,23,24. La struttura trabecolare ossea subcondrale e lo spessore osseo subcondrale delle capre sono simili a quelli degli esseri umani, e la proporzione della cartilagine rispetto all'osso è anche segnalata per essere vicina agli esseri umani21. Inoltre, le capre sono state ampiamente addomesticate in tutto il mondo, rendendole facilmente disponibili quando sono scheletricamente mature. Inoltre, i bassi costi di manutenzione e la facilità d'uso li hanno resi un modello animale attraente per la ricerca22.
Nel presente studio viene dimostrato un semplice protocollo per l'isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione soffocante di Capra aegagrus hircus (capra) e le condizioni di coltura in vitro per la loro espansione e differenziazione. Le cellule isolate sono aderenti, hanno morfologia simile alle MSC, formano colonie CFU-F (unità formanti colonie-fibroblasti) e possiedono un potenziale di differenziazione adipogenico, condrogeno e ostegenico. Pertanto, le IFP-MSC mostrano il potenziale come fonte alternativa di MSC per applicazioni biomediche.
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Protocol
Il protocollo si basa sull'isolamento delle IFP-MSC dalle capre. Capra IFP e sangue sono stati raccolti da un mattatoio locale. Poiché tali collezioni di tessuti sono al di fuori della competenza di un comitato etico istituzionale per gli animali, non era richiesta l'approvazione etica.
1. Isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione femorotibiale del ginocchio di capra
- Raccogliere l'articolazione femorotibiale della capra (campione) che comprende ~ 15 cm ciascuna delle regioni femorali e tibiali degli arti posteriori. Posizionare immediatamente il campione in una scatola di raccolta del campione sterilizzata e conservarlo a 4 °C per il trasporto al laboratorio per ulteriori elaborazioni. Elaborare i campioni in modo asettico in un armadio di biosicurezza, utilizzando strumenti chirurgici sterilizzati durante tutta la procedura (Figura 1, Fase 1).
- Posizionare il campione su una capsula di Petri da 150 mm e sciacquarlo abbondantemente con soluzione salina tamponata con fosfato autoclavata (PBS) integrata con antibiotici (5 μg/mL di amfotericina B, 200 U/mL di penicillina-streptomicina e 50 μg/mL di ciprofloxacina) per evitare la contaminazione. Assicurarsi sempre che il campione sia mantenuto idratato utilizzando PBS.
- Esaminare attentamente le regioni anatomiche del campione. Per facilitare l'accesso alla capsula articolare, assicurarsi che i tessuti extra da entrambe le ossa lunghe siano completamente rimossi (Figura 1, Fase 2).
- Per ottenere ciò, in primo luogo, tenere la superficie terminale dell'osso del femore con una mano e, con forbici affilate, tagliare longitudinalmente verso l'articolazione. Rimuovere i muscoli circostanti e il tessuto adiposo dall'osso durante il processo. Fare attenzione che il tessuto che circonda la capsula articolare immediata rimanga inizialmente indisturbato.
- Allo stesso modo, fare un'altra incisione all'estremità tibiale del campione e rimuovere i muscoli e il tessuto adiposo dall'osso tibiale. Assicurarsi che entrambe le ossa lunghe siano completamente esposte e che la capsula articolare sia chiaramente visibile dopo questo passaggio (Figura 1, Fase 3).
- Quindi, praticare un'incisione da entrambi i lati della membrana sinoviale per tagliare l'articolazione articolare (Figura 1, Fase 4). Tagliare la rotula sia dalla membrana sinovivia che dai legamenti rotulei usando un nuovo lotto di forbici e pinze sterilizzate. Conservare immediatamente la rotula separata in una capsula di Petri contenente PBS (Figura 1, Passo 5).
- Rimuovere l'intero cuscinetto adiposo presente sulla superficie interna della rotula usando forbici e pinze e raccogliere il cuscinetto adiposo in un'altra capsula di Petri fresca (Figura 1, Passo 6). Tritare il cuscinetto di grasso raccolto usando un bisturi. Includere altri strumenti chirurgici (ad esempio, forbici o lame chirurgiche) come richiesto per ottenere i pezzi / segmenti di grasso più piccoli possibili di ~ 2-3 mm.
NOTA: Una buona macinazione è fondamentale per ottenere una buona resa di cellule. Mantenere sempre il tessuto idratato e non lasciarlo asciugare in nessuna fase della procedura di isolamento. - Trasferire il tessuto tritato utilizzando una spatola in una provetta da centrifuga da 50 ml e lavarlo con PBS integrato con antibiotici a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti in un miscelatore per provetta. Ripetere la fase di lavaggio 3 volte, 15 minuti ciascuna.
- Per la digestione enzimatica, incubare il tessuto tritato (~5 g) nel terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM a basso glucosio) contenente 1,5 mg/ml di collagenasi di tipo II (20 ml) e integrato con FBS al 2% a 37 °C per 12-16 ore.
NOTA: Eseguire la digestione in un miscelatore per provette a ~ 15 rotazioni al minuto (RPM). - Aspirare con cura il tessuto digerito e filtrarlo attraverso un filtro cellulare (70 μm) per rimuovere qualsiasi tessuto non digerito. Centrifugare il filtrato in una provetta da 15 mL a 150 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con DMEM a basso contenuto di glucosio almeno 2x.
NOTA: Versare lentamente il tessuto digerito nel filtro per evitare fuoriuscite. Utilizzare un tubo da centrifuga a basso volume (15 ml) per ottenere un buon pellet. - Risospendere il pellet cellulare ottenuto in mezzi DMEM completi (DMEM a basso glucosio integrato con 10% FBS e antibiotici [2,5 μg / mL amfotericina, 100 U / mL penicillina-streptomicina e 25 μg / mL ciprofloxacina]), indicato come mezzo di espansione nel protocollo nelle fasi successive.
- Seminare le cellule su piastre di Petri da 150 mm e coltivarle nel mezzo di espansione integrato con 5 ng / mL fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) e 50 μg / mL di sale trisodico dell'acido 2-fosfo-L-ascorbico. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per consentire alle cellule di aderire e proliferare. Monitorare l'attaccamento e la crescita delle cellule su base giornaliera.
2. Mantenimento ed espansione delle cellule isolate
- Cambiare il mezzo ogni 3 giorni fino a quando le cellule diventano confluenti. Aggiungere sale trisodico fresco 5 ng/mL bFGF e 50 μg/mL di acido 2-fosfo-L-ascorbico direttamente nella capsula di Petri ogni volta che il mezzo viene cambiato. Dopo che le cellule diventano confluenti all'80% -90%, sottocolture le cellule.
NOTA: rimuovere le entità non aderenti durante ogni modifica del supporto. Nel caso in cui si vedano goccioline di olio dopo 3 giorni di incubazione, lavare le cellule con PBS 1x e quindi aggiungere nuovi mezzi alla capsula di Petri. Continuare con il lavaggio PBS prima di ogni cambio di fluido fino a completa rimozione delle goccioline d'olio. - Sub-coltura delle cellule: rimuovere il mezzo di espansione dalla piastra di Petri e lavare le cellule 1x con PBS. Aggiungere 4 ml di tripsina/EDTA allo 0,25% al piatto e incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per 4 minuti.
NOTA: Confluency (80%-90%) viene raggiunto entro 7 giorni. Distribuire uniformemente la soluzione di tripsina/EDTA su tutta la superficie della capsula di Petri durante la tripsinizzazione. - Rimuovere le cellule toccando la piastra sul lato e osservando al microscopio per confermare che tutte le cellule sono staccate. Neutralizzare la tripsina dopo aver aggiunto un volume uguale (4 ml) di mezzo di espansione.
- Raccogliere le cellule dissociate utilizzando una pipetta in un tubo di polipropilene fresco da 15 mL e centrifugare a 150 x g per 5 minuti a RT. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet nel volume desiderato di mezzi di espansione.
- Contare le cellule utilizzando il metodo standard di conteggio delle cellule e la sottocoltura in piastre di Petri da 150 mm ad una densità di semina di 1 x 104 celle/cm2 per un'ulteriore espansione. Per tutti i test, utilizzare un monostrato confluente di celle di passaggio numero P2-P5.
NOTA: Crioconservare le cellule in eccesso.
3. Valutazione della capacità clonogenica di IFP-MSCs mediante il saggio formante colonie (CFU-F)
- Per il test CFU-F, seminare le cellule in mezzi di espansione in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti ad una densità di semina di 50-100 cellule / cm2. Aggiungere il supporto per ottenere un volume finale di 3 ml.
NOTA: Ottimizzare la concentrazione cellulare per saggi e trattamenti. - Coltivare le cellule per 12 giorni a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 in condizioni di coltura standard per consentire alle cellule di formare colonie. Cambiare il supporto ogni 3 giorni. Sii gentile mentre cambi i media.
- Dopo 12 giorni, sciacquare le colonie 1x con PBS e fissarle usando il 20% di metanolo per 20 minuti a RT. Colorare le colonie con colorante viola cristallino (0,5% [w / v] in 20% di metanolo) per 20 minuti a RT. Contare le singole colonie usando un microscopio invertito.
NOTA: una colonia è definita come un gruppo di più di 50 cellule.
4. Potenziale di differenziazione delle IFP-MSC
- Indurre il differenziamento adipogenico delle IFP-MSC
- Per indurre l'adipogenesi, seminare le cellule ad una densità di 25 x 103 cellule/cm2 in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Aggiungere il mezzo per ottenere un volume finale di 500 μL. Coltivare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
- Un giorno dopo la confluenza, sostituire il mezzo di espansione con 500 μL di terreno di differenziazione adipogenica. Richiede circa 2 giorni affinché le cellule raggiungano la confluenza.
- Preparare i terreni di differenziazione adipogenica integrando i mezzi di espansione (DMEM + 10% FBS + 2,5 μg/mL di amfotericina, 100 U/mL di penicillina-streptomicina e 25 μg/mL di ciprofloxacina) con 25 mM di D (+)-glucosio, 10 μg/mL di insulina, 1 μM di desametasone e 100 μM di indometacina.
NOTA: Il mezzo di differenziazione è instabile a 4 °C dopo 1 mese; Quindi, preparare i supporti come e quando richiesto. - Considerare le cellule coltivate nel mezzo di espansione integrato con 25 mM D (+) glucosio come controlli non indotti. Cambiare il supporto ogni 3 giorni per 14 giorni. Alla fine dei 14 giorni, lavare le celle 1x con PBS. Fissare le cellule usando formalina tamponata neutra (NBF; 4 % formaldeide in PBS) per 15 minuti a 4 °C.
- Dopo la fissazione, lavare i pozzetti 1x con acqua distillata e quindi incubare le cellule con isopropanolo al 60% per 5 minuti a RT. Dopo aver rimosso l'isopropanolo, colorare le goccioline lipidiche incubando le cellule con 500 μL della soluzione di lavoro del colorante Oil Red O per 5 minuti a RT. Lavare i pozzetti 1x con acqua distillata per rimuovere il colorante non legato e visualizzare le cellule usando un microscopio invertito.
NOTA: Preparare la soluzione madre di Oil Red O (ORO) sciogliendo 300 mg di ORO in 100 mL di isopropanolo al 99%. Per preparare la soluzione di lavoro, mescolare tre parti di brodo ORO e due parti di acqua distillata e lasciare miscelare a RT per 10 minuti. Filtrare la miscela con carta da filtro da 0,2 μm. La soluzione di lavoro è pronta all'uso. La soluzione madre può essere preparata e conservata presso RT per 1 mese al buio, mentre la soluzione di lavoro deve essere preparata al momento prima di ogni utilizzo/colorazione.
- Indurre la differenziazione condrogena delle MSC IFP
- Isolamento del plasma di capra:
- Preparare il 3,4% (p/v) di sodio-citrato in acqua distillata. Aggiungere 5 mL della soluzione di citrato di sodio preparata in una provetta da centrifuga da 50 ml.
- Raccogliere 45 ml di sangue di capra appena isolato nello stesso tubo. Inclinare immediatamente il tubo per mescolare accuratamente il sangue con citrato di sodio per evitare la coagulazione e trasportarlo in laboratorio a 4 °C.
- Centrifugare il sangue di capra raccolto a 1000 x g per 20 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante (plasma) in un tubo fresco all'interno di un armadio di biosicurezza. Filtrare il plasma attraverso filtri da 0,2 μm, aliquote, e conservare a -20 °C per un ulteriore utilizzo.
NOTA: Mantenere la temperatura di 2-8 °C durante la manipolazione dei campioni. È importante ridurre al minimo i cicli di congelamento-scongelamento del plasma.
- Coltivare le cellule espanse fino alla confluenza dell'80%-90%, dissociare le cellule usando la soluzione di tripsina/EDTA e pellettare le cellule a 150 x g per 5 minuti in una provetta da centrifuga da 15 ml. Risospendere il pellet nel plasma di capra ad una densità di 2 x 106 cellule per 50 μL di soluzione plasmatica.
- Aggiungere una goccia di cellule contenenti plasma (50 μL) su una capsula di Petri sterilizzata da 90 mm e quindi aggiungere cloruro di calcio ad una concentrazione finale dello 0,3% (p/v). Mescolare bene per fabbricare idrogel di plasma reticolato.
- Incubare l'idrogel fabbricato a 37 °C per 40 minuti. Dopo l'incubazione, trasferire gli idrogel in piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti contenenti mezzi condrogeni.
- Preparare i mezzi condrogenici integrando DMEM a basso glucosio con 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES), 1,25 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA), 1 mM di prolina, 50 μg/mL di sale trisodico dell'acido 2-fosfo-L-ascorbico, 100 nM desametasone, 1x insulina, transferrina, selenito di sodio + linoleic-BSA (ITS+1), antibiotici (2,5 μg/mL di amfotericina, 100 U/mL di penicillina-streptomicina e 25 μg/mL di ciprofloxacina), e 10 ng/mL fattore di crescita trasformante- β1 (TGF-β1).
- Gli idrogel coltivati in mezzi DMEM completi (DMEM basso glucosio con 10% FBS e antibiotici [2,5 μg / mL amfotericina, 100 U / mL penicillina-streptomicina e 25 μg / mL ciprofloxacina]) senza TGF-β1 sono considerati controlli non indotti. Cambiare il supporto ogni 3 giorni per 14 giorni.
- Dopo 14 giorni di differenziazione condrogena delle cellule negli idrogel plasmatici, lavare gli idrogel con PBS 3x per 5 minuti ciascuno e quindi fissare i campioni in NBF per 3 ore.
ATTENZIONE: La formaldeide è un potenziale cancerogeno e può causare irritazione al naso, alla gola e ai polmoni per inalazione. Eseguire tutte le procedure relative alla formaldeide in una cappa aspirante. - Rimuovere NBF, lavare gli idrogel con PBS 3x per 5 minuti ciascuno, quindi incubare in saccarosio al 35% (p/v) a RT durante la notte per consentire alla soluzione di essere completamente assorbita nei campioni. Acclimatare gli idrogel in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) per 3 ore. Incorporare i campioni nel composto OCT utilizzando stampi in silicone sotto azoto liquido.
- Tagliare i campioni ad uno spessore di 10-12 μm su vetrini rivestiti di gelatina utilizzando una criotome e conservarli a -20 °C per un uso futuro. Per esaminare la presenza o la deposizione della matrice extracellulare dopo differenziazione condrogena, colorare le sezioni con blu di Alcian e colorante Safranin-O, che si legano ai glicosaminoglicani solfatati.
NOTA: Per preparare il colorante Alcian Blue, sciogliere 1 g di colorante Alcian Blue in 100 mL di 0,1 N HCl e mescolare accuratamente in un miscelatore per provette durante la notte. La soluzione può essere conservata presso RT per 1 mese al buio. Per preparare il colorante Safranin-O, sciogliere 0,1 g di colorante Safranin-O in 100 ml di acqua distillata e mescolare accuratamente in un miscelatore per provette durante la notte. - Per la colorazione Alcian Blue, lavare le sezioni di idrogel 1x con acqua distillata per 5 min. Per sistemare le sezioni, aggiungere il 4% di NBF alle diapositive e incubare per 30 minuti.
- Lavare le sezioni 1x con acqua distillata per 5 minuti e poi 2x con 0,1 N HCl per 30 s ciascuna. Rimuovere l'HCl e asciugare delicatamente i vetrini con carta velina. Aggiungere la colorazione Alcian Blue preparata alle sezioni e incubare per 30 minuti a 37 °C in una camera umidificata.
- Lavare il colorante non legato con 0,1 N HCl e quindi distillare acqua per 3 minuti. Disidratare le sezioni in etanolo assoluto, eliminarle in xilene e infine montare le sezioni colorate in un mezzo resinoso per l'imaging.
- Per la colorazione Safranin-O, lavare le sezioni di idrogel con acqua distillata 1x per 5 min. Per sistemare le sezioni, aggiungere il 4% di NBF alle diapositive e incubare per 30 minuti. Lavare le sezioni 1x con acqua distillata per 5 minuti, quindi immergere i vetrini in acido acetico all'1% per 10-15 s. Asciugare delicatamente i vetrini con carta velina.
- Aggiungere il colorante Safranin-O preparato alle sezioni e incubare per 10 minuti a RT. Lavare il colorante non legato con etanolo al 100%. Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 5 minuti. Asciugare all'aria i vetrini, pulirli in xilene e infine montare le sezioni colorate in un mezzo resinoso per l'imaging.
- Isolamento del plasma di capra:
- Indurre la differenziazione osteogenica delle MSC IFP
- Per indurre la differenziazione osteogenica, tripsinizzare le cellule, come affermato in precedenza (Passo 2.2.). Seminare le cellule ad una densità di 3 x 103 cellule/cm2 in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Aggiungere il mezzo per ottenere un volume finale di 500 μL. Coltivare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 . 1 giorno dopo la semina, sostituire il mezzo di espansione con un mezzo di differenziazione osteogenica da 500 μL.
- Preparare il terreno osteogenico integrando i mezzi di espansione (DMEM + 10% FBS +2,5 μg/mL di amfotericina, 100 U/mL di penicillina-streptomicina e 25 μg/mL di ciprofloxacina) con 25 mM di D (+)-glucosio, 10 nM di desametasone, 10 mM di β-glicerofosfato, 50 μg/mL di sale trisodico dell'acido 2-fosfo-L-ascorbico e 10 nM di vitamina D3.
NOTA: Le cellule coltivate in mezzi di espansione integrati con 25 mM di glucosio D (+) sono considerati controlli non indotti. - Cambiare il mezzo osteogenico ogni 3 giorni per 14 giorni o 28 giorni. Alla fine di 14 giorni, misurare l'entità dell'osteogenesi mediante colorazione con fosfatasi alcalina (ALP).
NOTA: Per preparare il substrato per la colorazione ALP, sciogliere una compressa di 5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil Fosfato (BCIP)/Nitroblue Tetrazolium (NBT) in 10 mL di acqua distillata in una provetta da centrifuga da 15 ml. Lasciare che la compressa si dissolva completamente. La soluzione di substrato è pronta all'uso. Poiché la soluzione di substrato non può essere conservata per una durata più lunga, in base alle necessità, rompere la compressa a metà e scioglierla in 5 ml di acqua distillata. Per preparare il tampone di permeabilizzazione, aggiungere tampone Tris (100 mM) e cloruro di magnesio (5 mM) all'acqua distillata. Aggiungere Triton X100 (0,1%) alla soluzione e lasciarla sciogliere. Regolare il pH della soluzione a 9,25-9,75. - Per la colorazione ALP, dopo 14 giorni di induzione, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con PBS. Fissare le celle usando NBF (4%) per 1 min. Lavare le cellule con PBS e permeare usando il tampone di lisi preparato per 2-3 minuti.
- Aggiungere 500 μL della soluzione di substrato preparata alle cellule e lasciarla incubare per 15 minuti a 1 ora, a seconda del livello di espressione. Controlla lo sviluppo del colore viola / blu in mezzo.
- Rimuovere la soluzione di substrato e lavare con acqua distillata. Immagina le cellule colorate usando un microscopio invertito.
- Alla fine di 28 giorni, misurare l'entità della calcificazione dopo l'induzione osteogenica mediante colorazione Alizarin Red-S.
NOTA: Per preparare la soluzione colorante Alizarin Red-S (40 mM), sciogliere 2 g di Alizarin Red-S in 100 mL di acqua distillata e regolare il pH a 4,1-4,3 con HCl o NH4OH. Filtrare la soluzione attraverso una membrana da 0,22 μm e conservare a 4 °C al buio. Il pH della soluzione è importante; quindi si raccomanda di fare una soluzione fresca o di rimisurare il pH della soluzione se ha più di 1 mese. - Per la colorazione di Alizarin Red-S, dopo 28 giorni di induzione, rimuovere il mezzo e lavare le cellule 1x con PBS freddo. Fissare le celle utilizzando etanolo al 70% per 1 ora a 4 °C.
- Rimuovere il fissativo e lavare le celle 2 volte con acqua distillata. Rimuovere completamente l'acqua e aggiungere 1 ml di soluzione di Alizarin Red-S a ciascun pozzetto.
- Incubare le cellule con la soluzione per 1 ora a RT e visualizzare le cellule utilizzando un microscopio invertito.
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Representative Results
Isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione femorotibiale della capra
Le fasi coinvolte nell'isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione soffocante di una capra sono illustrate nella Figura 1. Il cuscinetto adiposo presente nella superficie interna non articolata della rotula è stato rimosso, tritato e digerito enzimaticamente. Le IFP-MSC sono state isolate e coltivate con successo in vitro (Figura 2A).
Espansione e capacità clonogenica delle IFP-MSCs
Le cellule isolate sono state coltivate in vitro in mezzi di espansione. Le cellule hanno iniziato ad aderire alla piastra di coltura tissutale entro 12 ore dalla semina ed erano per lo più di forma rotonda al giorno 0. Erano omogeneamente aderenti alla placca e raggiungevano una morfologia allungata entro 24 ore. Questa morfologia è stata mantenuta per tutta la durata della cultura. Le cellule proliferarono in modo efficiente in coltura e divennero confluenti all'80%-90% entro 6 giorni dall'espansione (Figura 2A). Inoltre, le cellule isolate hanno mostrato capacità clonogenica, valutata mediante test CFU-F) di unità formanti colonie (CFU-F) (Figura 2B). Questi risultati indicano che le cellule isolate hanno efficienti capacità proliferative e di auto-rinnovamento in vitro.
Potenziale di differenziazione delle IFP-MSC
Per caratterizzare se le cellule isolate fossero multipotenti e possedessero caratteristiche caratteristiche delle MSC, sono state indotte a differenziarsi in più lignaggi. Le cellule isolate, quando indotte verso la linea adipogena, hanno prodotto goccioline lipidiche, come si può osservare dalle immagini in campo luminoso (Figura 3A). Ciò è stato ulteriormente confermato dalla colorazione Oil Red O il giorno 14 e il giorno 21, suggerendo la capacità di queste cellule di differenziarsi in adipociti. D'altra parte, non sono state osservate goccioline di olio visibili nelle cellule coltivate in assenza di fattori induttori adipogeni (Figura 3B,C).
Per determinare il potenziale condrogeno delle cellule isolate, le cellule sono state incapsulate in idrogel plasmatico e sono state autorizzate a differenziarsi nella linea condrogena. Come illustrato dalle immagini grossolane dell'idrogel plasmatico (Figura 4A), il neotessuto formato dopo 14 giorni nel gruppo indotto appariva bianco e lucido (simile alla cartilagine articolare), mentre nel gruppo non indotto era bianco pallido ed è stata osservata una ridotta lucentezza. Inoltre, le cellule del gruppo indotto sono state in grado di secernere uno dei componenti principali della matrice cartilaginea (cioè glicosaminoglicani solfatati), evidenziato dalla colorazione istologica positiva per il blu di Alcian (Figura 4B) e la Safranina O (Figura 4C). Al contrario, le sezioni di idrogel dei gruppi non indotti erano negative per la colorazione Safranin O e Alcian Blue. Questi risultati indicano collettivamente il potenziale di differenziazione condrogena delle MSC solo in presenza di stimoli condrogeni.
Le cellule isolate hanno anche dimostrato un potenziale di differenziazione osteogenica. Dopo 14 giorni e 21 giorni in coltura, non è stata osservata alcuna mineralizzazione spontanea (gruppo non indotto). Tuttavia, quando indotta con mezzi osteogenici, la mineralizzazione era evidente dalla colorazione positiva per fosfatasi alcalina (ALP) alla fine di 14 giorni (Figura 5A). Inoltre, dopo 28 giorni di coltura in terreni osteogenici, le deposizioni calcificate sono state visualizzate mediante colorazione positiva Alizarin Red-S (Figura 5B). Questi risultati dimostrano che le cellule isolate dal grasso infrarotuleo di capra, quando indotte, hanno il potenziale per differenziarsi in linee adipogeniche, condrogeniche e osteogeniche.
Figura 1: Schema per l'isolamento di IFP-MSC dall'articolazione soffocante del ginocchio di capra. Passo 1. Raccogliere il campione di ginocchio di capra dal macello e procedere con la dissezione in un armadio di biosicurezza; Passo 2. Esaminare attentamente l'anatomia del tessuto e rimuovere i muscoli circostanti e il tessuto adiposo; Passo 3. Senza disturbare la capsula articolare, rimuovere i muscoli e i tessuti adiposi per esporre completamente entrambe le ossa lunghe (femore e tibia); Passo 4. Fare un'incisione nella membrana sinovivia e tagliare l'articolazione articolare per esporre la rotula e la cartilagine trocleare; Passo 5. Rimuovere accuratamente la rotula dall'articolazione articolare, senza disturbare il cuscinetto adiposo infrarotuleo (IFP), e tenerla su una capsula di Petri contenente PBS; Passo 6. Rimuovere lentamente l'intero cuscinetto di grasso dalla rotula e tenerlo in una capsula di Petri fresca per tritare e digestione enzimatica. (a. Femore, b. Tibia, c. Rotula, d. Cartilagine trocleare, e. Cuscinetto adiposo infrarotuleo). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Morfologia e potenziale clonogenico delle IFP-MSC . (A) Le micrografie sono state prese al passaggio 3 utilizzando un microscopio a campo luminoso invertito con ingrandimento 10x. Immediatamente dopo la semina (giorno 0), le cellule sono rimaste di forma rotonda, al giorno 3 la maggior parte delle cellule ha raggiunto una morfologia allungata e il giorno 6 le IFP-MSC sono diventate confluenti all'80% -90% (barra di scala = 100 μm). (B) Immagini rappresentative (n = 3) di colonie CFU-F colorate con colorante viola cristallo dopo 12 giorni di semina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Differenziazione adipogenica delle IFP-MSC. Il pannello superiore indica le micrografie di IFP-MSC non indotte e il pannello inferiore rappresenta le IFP-MSC indotte nella linea adipogenetica. (A) Immagini rappresentative in campo chiaro che mostrano la formazione di vacuoli lipidici durante l'adipogenesi (Scale bar = 100 μm). Immagini rappresentative della colorazione Oil Red O delle goccioline lipidiche al (B) giorno 14 e (C) giorno 21 di differenziazione (Scale bar = 20 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Differenziazione condrogena delle IFP-MSC. Il pannello superiore indica costrutti/sezioni di idrogel da idrogel non indotto e il pannello inferiore rappresenta idrogel sottoposto a condrogenesi. (A) Immagini grossolane di costrutti di idrogel plasmatico dopo 14 giorni in coltura in assenza (non indotta) o presenza (indotta) di mezzi condrogeni integrati con TGF-β1. Immagini rappresentative di sezioni da 10 μm di idrogel colorate con colorante legante sGAG (B) Alcian Blue (blu) e (C) Safranin O (rosso) (Scale bar = 100 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Differenziazione osteogenica delle IFP-MSC. Il pannello superiore indica le cellule non indotte e il pannello inferiore indica le cellule indotte con mezzi osteogenici. Micrografie e immagini rappresentative di IFP-MSC colorate con (A) BCIP-NBT (fosfatasi alcalina) dopo 14 giorni e (B) Alizarin Red-S (deposizione di calcio) dopo 28 giorni di differenziazione (Scale bar = 100 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Nel presente protocollo è stato fornito un metodo semplice, affidabile e riproducibile per l'isolamento delle MSC dall'IFP caprino. Le cellule isolate con questo metodo sono state utilizzate con successo nei nostri precedenti studi per la rigenerazione tissutale in vitro. È stato osservato che le cellule isolate erano proliferative, rispondevano a vari fattori di crescita e conservavano la loro attività biologica quando seminate su fibre elettrofilate e scaffold25,26. Inoltre, è stato osservato che un gran numero di MSC di alta qualità possono essere ottenute e co-coltivate con condrociti in idrogel iniettabili per ingegnerizzare la cartilagine articolare in vitro27,28,29. Mentre la procedura per la dissezione e l'isolamento delle cellule è semplice, ci sono alcuni passaggi che devono essere seguiti attentamente per il successo dell'isolamento e dell'espansione delle MSC da IFP. In primo luogo, poiché non è possibile mantenere condizioni veramente asettiche durante il trasporto del campione dal macello, si consiglia di pulire il tessuto esterno con etanolo al 70% per sterilizzare il tessuto prima di iniziare la procedura di isolamento. Il prossimo passo importante è sezionare il cuscinetto di grasso dall'articolazione del ginocchio. L'IFP si trova sotto la rotula nell'articolazione del ginocchio. L'estremità prossimale dell'IFP è attaccata all'estremità distale della rotula30,31. Quindi, diventa molto importante identificare la posizione corretta della rotula durante l'esecuzione della procedura di isolamento. Successivamente, poiché l'IFP si articola con la cartilagine trocleare nel femore ed è coperta dalla membrana sinoviale30,31, è necessario praticare un'incisione alla membrana sinoviale per aprire l'articolazione del ginocchio. È anche fondamentale osservare la salute generale del cuscinetto di grasso infrarotuleo raccolto. Poiché l'IFP è composto da adipociti (cellule) e tessuto connettivo adiposo, come collagene e glicosaminoglicani, il tessuto viene tritato e digerito utilizzando l'enzima collagenasi per rilasciare le cellule 9,32. Gli adipociti galleggianti vengono separati mediante centrifugazione a bassa velocità per avere una coltura omogenea di MSC. Gli adipociti rimanenti nella frazione vascolare stromale devono essere rimossi dalla piastra di coltura tissutale ad ogni cambio di terreno lavando il monostrato cellulare con PBS prima di aggiungere nuovi mezzi. Questo passaggio deve essere continuato fino a quando tutti gli adipociti visibili non vengono rimossi. Si suggerisce di riseminare le cellule in una nuova piastra dopo che le cellule P0 raggiungono la confluenza per sbarazzarsi degli adipociti rimanenti, che potrebbero aver aderito alla parete della piastra e sono difficili da rimuovere. Infine, poiché i campioni di capra sono per lo più ottenuti da un macello, è difficile rintracciare l'età esatta della capra e, pertanto, durante l'isolamento delle cellule, la variazione tra i campioni deve essere attentamente osservata e documentata. Si suggerisce di caratterizzare le cellule per l'auto-rinnovamento (CFU-F), la proliferazione e il potenziale di differenziazione dopo ogni isolamento prima che vengano utilizzate per varie applicazioni e studi meccanicistici. A causa della necessità di un gran numero di cellule nelle applicazioni di ingegneria tissutale basate su cellule, le condizioni di coltura che facilitano la proliferazione, ritardano la senescenza e mantengono la staminalità delle cellule diventano di importanza centrale. È stato osservato che le MSC coltivate in sale trisodico dell'acido 2-fosfo-L-ascorbico (PAA) e nel fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF) hanno mostrato un aumento di ~ 42 volte del loro numero rispetto alle MSC coltivate solo in bFGF. Inoltre, il co-trattamento di PAA e bFGF ha ridotto la produzione di specie reattive dell'ossigeno (grazie alle loro proprietà antiossidanti) e la senescenza nelle cellule staminali. Pertanto, l'uso di PAA durante l'espansione in vitro delle MSC è auspicabile33.
Mentre la digestione enzimatica dei tessuti è universalmente impiegata ed è un metodo efficiente per isolare le MSC, l'uso di enzimi come le collagenasi richiede tempo e denaro34. Nel presente studio, la digestione completa del tessuto utilizzando collagenasi ha richiesto 12-16 ore (durante la notte), il che potrebbe portare a una diminuzione della vitalità o ad un alterato fenotipo superficiale delle cellule35. Quindi, il metodo può essere ulteriormente ottimizzato per ridurre la durata del trattamento con collagenasi per la digestione dei tessuti. In alternativa, un metodo di coltura di espianto privo di enzimi utilizzato per l'isolamento di MSC derivate da lipoaspirati o cuscinetti di grasso inguinale può anche essere esplorato per l'isolamento di IFP-MSCs34,36,37.
Le IFP-MSC, grazie alla loro capacità di differenziarsi in linee condrogene, adipogene e osteogeniche, possiedono un ampio potenziale terapeutico. Precedenti studi hanno dimostrato che le IFP-MSC presentano un potenziale condrogeno migliore rispetto ad altre cellule staminali 6,7,9,10. Quindi, le IFP-MSC hanno guadagnato interesse e sono considerate un candidato migliore per la terapia cellulare per la riparazione dei difetti della cartilagine e alleviare la degradazione della cartilagine nell'osteoartrite. In uno studio preclinico, la co-somministrazione di IFP-MSCs con componenti della matrice extracellulare della cartilagine attraverso l'iniezione intraarticolare ha determinato una maggiore rigenerazione della cartilagine nei difetti osteocondrali38. Allo stesso modo, l'iniezione intra-articolare di IFP-MSCs nel modello di osteoartrite di coniglio (OA) ha portato a una diminuzione dei seguenti parametri di malattia: degradazione della cartilagine, formazione di osteofiti, ispessimento osseo subcondrale e sinovite39. Inoltre, i risultati di uno studio clinico randomizzato13 precedentemente riportato e di uno studio clinico di fase 140 di livello aperto pubblicato di recente hanno dimostrato che le iniezioni intra-articolari di IFP-MSC in pazienti con osteoartrosi del ginocchio sono sicure e determinano la riduzione del dolore e il miglioramento della funzione articolare, indicando il loro promettente potenziale terapeutico nel migliorare le complicanze correlate all'OA del ginocchio. Le IFP-MSCs hanno anche dimostrato di sviluppare proprietà immunomodulatorie aumentate in presenza di segnali proinfiammatori facilitando la degradazione di un regolatore infiammatorio, la Sostanza P (SP), portando ad una riduzione delle molecole proinfiammatorie e cataboliche e, di conseguenza, a un migliore trattamento dell'infiammazione e della fibrosi della sinovia e dell'IFP6 . Ancora più importante, le IFP-MSC elaborate in condizioni conformi alle normative hanno mostrato una migliore proliferazione, capacità di differenziazione e proprietà immunomodulatorie rispetto alle condizioni standard di coltura in vitro, il che dimostra il loro potenziale di successo clinico quando utilizzate per la terapia basata su cellule staminali mesenchimali (MSC)41.
In conclusione, il presente protocollo descrive l'isolamento di cellule staminali mesenchimali (MSC) derivate da cuscinetti di grasso infrarotuleo (IFP) da un'articolazione di soffocamento della capra mediante digestione enzimatica e il loro mantenimento in coltura. Le cellule isolate hanno un potenziale proliferativo e di auto-rinnovamento e possono differenziarsi in linee adipogeniche, ostegeniche e condrogene. Le IFP-MSC sono una fonte promettente di MSC e hanno un potenziale traslazionale per le applicazioni di medicina rigenerativa.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
SH riconosce il supporto dell'Institute Post-Doctoral Fellowship di IIT Kanpur e la sovvenzione SYST di DST (SEED Division) (SP / YO / 618 / 2018). AM riconosce l'Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) per una borsa di studio dell'Istituto. DSK riconosce Gireesh Jankinath Chair Professorship e Department of Biotechnology, India, per il finanziamento (BT / PR22445 / MED / 32/571 / 2016). AM, SH e DSK ringraziano il Mehta Family Centre for Engineering in Medicine di IIT-Kanpur per il loro generoso supporto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422-10G | 10 mM |
| 0.25% Trypsin- 0.02% EDTA | Hi-Media | TCL049 | |
| 15-mL centrifuge tube | Corning | ||
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | 50 µg/mL |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | HiMedia | TCL021-50ml | 10 mM |
| 50-mL centrifuge tube | Corning | ||
| Alcian Blue | Hi-Media | RM471 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Alizarin Red S | S D Fine-Chem Limited | 26048-25G | For calcium deposition |
| Amphotericin B | HiMedia | A011 | 2.5 µg/mL |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Sino Biologicals | 10014-HNAE | 5 ng/mL |
| BCIP/NBT ALP Substrate | Sigma | B5655-5TAB | For ALP staining |
| Biological safety cabinet | |||
| BSA | HiMedia | MB-083 | Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL ) |
| Cell strainer | HiMedia | TCP-182 | 70 µm |
| Centrifuge | REMI | ||
| Ciprofloxacin | RANBAXY LAB. Limited | B17407T1 | 2.5 µg/mL |
| Crystal Violet | S D Fine-Chem Limited | 42555 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.94925.0521 | 25 mM |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 µM |
| DMEM LG | SIGMA | D5523 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FBS | Gibco | 10270 | Long name: Fetal Bovine Serum |
| Formaldehyde solution 37%-41% | Merck | 61780805001730 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 µM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | 10 µg/mL |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS 100 | ||
| ITS + 1 | Sigma-Aldrich | I2521-5mL | Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA |
| L-Proline | HiMedia | TO-109-25G | 1 mM |
| Magnesium chloride | Merck | 61751605001730 | For lysis buffer |
| Methanol | Meck | 1.07018.2521 | |
| Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Thermoscientific | ||
| MUSE Cell analyser | Merck Millipore | For cell counting | |
| OCT compound | Tissue-Tek | 4583 | Long name: Optimal Cutting Temperature |
| Oil Red O dye | S D Fine-Chem Limited | 54304 | For lipid vacuole staining |
| Penicillin-Streptomycin | HiMedia | A007 | 100 U/mL |
| Petri dishes (150 mm and 90 mm) | NEST | ||
| Safranin O | S D Fine-Chem Limited | 50240 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C3434 | 3.4 % (w/v) |
| Sterile scissors, forceps and scalpels | For isolation of IFP-MSC | ||
| Sucrose | Merck | 1.94953.0521 | 35 % (w/v) |
| TGF-β1 | Sino Biologicals | Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL) | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Thermoscientific | ||
| Tris buffer | Merck | 61771405001730 | For lysis buffer |
| Triton X100 | S D Fine-Chem Limited | 40632 | For lysis buffer |
| Type II collagenase | Gibco | 17101015 | 1.5 mg/mL |
| Vitamin D3 | Sigma | C9756-1G | 10 nM |
| Well plates (6 -WP and 24-WP) | NEST |
References
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regenerative Medicine. 4 (1), 22 (2019).
- Guo, Y., Yu, Y., Hu, S., Chen, Y., Shen, Z. The therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cardiovascular diseases. Cell Death & Disease. 11 (5), 349 (2020).
- Ge, Z., Goh, J. C. H., Lee, E. H. Selection of cell source for ligament tissue engineering. Cell Transplantation. 14 (8), 573-583 (2005).
- Harvanová, D., Tóthová, T., Sarissky, M., Amrichová, J., Rosocha, J. Isolation and characterization of synovial mesenchymal stem cells. Folia Biologica. 57 (3), 119-124 (2011).
- Kouroupis, D., et al. Infrapatellar fat pad-derived MSC response to inflammation and fibrosis induces an immunomodulatory phenotype involving CD10-mediated Substance P degradation. Scientific Reports. 9 (1), 10864 (2019).
- Lopa, S., et al. Donor-matched mesenchymal stem cells from knee infrapatellar and subcutaneous adipose tissue of osteoarthritic donors display differential chondrogenic and osteogenic commitment. European Cells & Materials. 27, 298-311 (2014).
- Garcia, J., et al. Characterisation of synovial fluid and infrapatellar fat pad derived mesenchymal stromal cells: The influence of tissue source and inflammatory stimulus. Scientific Reports. 6 (1), 24295 (2016).
- Tangchitphisut, P., et al. Infrapatellar fat pad: an alternative source of adipose-derived mesenchymal stem cells. Arthritis. 2016, 4019873 (2016).
- Ding, D. -C., et al. Human infrapatellar fat pad-derived stromal cells have more potent differentiation capacity than other mesenchymal cells and can be enhanced by hyaluronan. Cell Transplantation. 24 (7), 1221-1232 (2015).
- Khan, W., Adesida, A., Tew, S., Andrew, J., Hardingham, T. The epitope characterisation and the osteogenic differentiation potential of human fat pad-derived stem cells is maintained with ageing in later life. Injury. 40 (2), 150-157 (2009).
- Koh, Y. G., et al. Mesenchymal stem cell injections improve symptoms of knee osteoarthritis. Arthroscopy. 29 (4), 748-755 (2013).
- Koh, Y. G., Choi, Y. J. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis. Knee. 19 (6), 902-907 (2012).
- Kouroupis, D., Willman, M. A., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell-based spheroids enhance their therapeutic efficacy to reverse synovitis and fat pad fibrosis. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 44 (2021).
- Stocco, E., et al. Infrapatellar fat pad stem cells responsiveness to microenvironment in osteoarthritis: from morphology to function. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 323 (2019).
- Hindle, P., Khan, N., Biant, L., Péault, B. The infrapatellar fat pad as a source of perivascular stem cells with increased chondrogenic potential for regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 77-87 (2017).
- Stolzing, A., Jones, E., McGonagle, D., Scutt, A. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (3), 163-173 (2008).
- Wu, C. L., Diekman, B. O., Jain, D., Guilak, F. Diet-induced obesity alters the differentiation potential of stem cells isolated from bone marrow, adipose tissue and infrapatellar fat pad: the effects of free fatty acids. International Journal of Obesity (2005). 37 (8), 1079-1087 (2013).
- Barboza, E., et al. Profibrotic infrapatellar fat pad remodeling without M1 macrophage polarization precedes knee osteoarthritis in mice with diet-induced obesity. Arthritis & Rheumatology. 69 (6), 1221-1232 (2017).
- Allen, M. J., Hankenson, K. D., Goodrich, L., Boivin, G. P., von Rechenberg, B. Ethical use of animal models in musculoskeletal research. Journal of Orthopaedic Research. 35 (4), 740-751 (2017).
- Moran, C. J., et al. The benefits and limitations of animal models for translational research in cartilage repair. Journal of Experimental Orthopaedics. 3 (1), (2016).
- Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11 (1), 19 (2016).
- Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
- Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. The Knee. 19 (4), 493-499 (2012).
- Bhutada, S. S., Sriram, M., Katti, D. S. Sulfated carboxymethylcellulose conjugated electrospun fibers as a growth factor presenting system for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 268, 118256 (2021).
- Waghmare, N. A., Arora, A., Bhattacharjee, A., Katti, D. S. Sulfated polysaccharide mediated TGF-β1 presentation in pre-formed injectable scaffolds for cartilage tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 193, 62-72 (2018).
- Arora, A., Mahajan, A., Katti, D. S. TGF-β1 presenting enzymatically cross-linked injectable hydrogels for improved chondrogenesis. Colloids & Surfaces B: Biointerfaces. 159, 838-848 (2017).
- Arora, A., Sriram, M., Kothari, A., Katti, D. S. Co-culture of infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cells and articular chondrocytes in plasma clot for cartilage tissue engineering. Cytotherapy. 19 (7), 881-894 (2017).
- Mahajan, A., Singh, A., Datta, D., Katti, D. S. Bioinspired injectable hydrogels dynamically stiffen and contract to promote mechanosensing-mediated chondrogenic commitment of stem cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (6), 7531-7550 (2022).
- Nakano, T., Wang, Y. W., Ozimek, L., Sim, J. S. Chemical composition of the infrapatellar fat pad of swine. Journal of Anatomy. 204 (4), 301-306 (2004).
- Sun, Y., Chen, S., Pei, M. Comparative advantages of infrapatellar fat pad: an emerging stem cell source for regenerative medicine. Rheumatology. 57 (12), 2072-2086 (2018).
- Han, W., et al. Infrapatellar fat pad in the knee: is local fat good or bad for knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 16 (4), 1-8 (2014).
- Bae, S. H., et al. L-ascorbic acid 2-phosphate and fibroblast growth factor-2 treatment maintains differentiation potential in bone marrow-derived mesenchymal stem cells through expression of hepatocyte growth factor. Growth Factors. 33 (2), 71-78 (2015).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Jing, W., et al. Explant culture: an efficient method to isolate adipose-derived stromal cells for tissue engineering. Artificial Organs. 35 (2), 105-112 (2011).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
- Toghraie, F., et al. Treatment of osteoarthritis with infrapatellar fat pad derived mesenchymal stem cells in Rabbit. The Knee. 18 (2), 71-75 (2011).
- Chen, H. -H., et al. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cell product for treatment of knee osteoarthritis: a first-in-human study with evaluation of the potency marker. Cytotherapy. 24 (1), 72-85 (2022).
- Kouroupis, D., Bowles, A. C., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. CD10/Neprilysin enrichment in infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cells under regulatory-compliant conditions: implications for efficient synovitis and fat pad fibrosis reversal. The American Journal of Sports Medicine. 48 (8), 2013 (2020).
