Summary
Infrapatellar fettkudde mesenkymala stamceller (IFP-MSC) kan enkelt isoleras från knäledens infrapatellära fettkudde. De sprider sig väl in vitro, bildar CFU-F-kolonier och differentierar till adilogen, kondrogen och osteogen härstamning. Häri tillhandahålls metoden för isolering, expansion och differentiering av IFP-MSC från getkvävningsled.
Abstract
IFP, som finns i knäleden, fungerar som en lovande källa till MSC. IFP är en lättillgänglig vävnad eftersom den rutinmässigt resekteras och kasseras under artroskopiska procedurer och knäbytesoperationer. Dessutom är dess borttagning förknippad med minimal sjuklighet på givarplatsen. Nya studier har visat att IFP-MSC inte förlorar sin spridningskapacitet under in vitro-expansion och har åldersoberoende osteogen differentieringspotential. IFP-MSC har överlägsen kondrogen differentieringspotential jämfört med benmärgshärledda MSC (BMSC) och fett-härledda stamceller (ADSC). Även om dessa celler lätt kan erhållas från åldrade och sjuka patienter, är deras effektivitet begränsad. Därför är det viktigt att använda IFP-MSC från friska givare för att bestämma deras effektivitet i biomedicinska applikationer. Eftersom tillgången till en frisk mänsklig donator är utmanande kan djurmodeller vara ett bättre alternativ för att möjliggöra grundläggande förståelse. Stora djur som hundar, hästar, får och getter spelar en avgörande roll i translationell forskning. Bland dessa kan geten vara en föredragen modell eftersom getens kvävningsled har den närmaste anatomin till den mänskliga knäleden. Dessutom kan get-IFP uppfylla de högre MSC-nummer som behövs för vävnadsregenereringsapplikationer. Dessutom gör låg kostnad, tillgänglighet och efterlevnad av 3R-principerna för djurförsök dem till en attraktiv modell. Denna studie visar ett enkelt protokoll för att isolera IFP-MSC från kvävningsfogen av getter och in vitro-odlingsförhållanden för deras expansion och differentiering. Den aseptiskt isolerade IFP från geten tvättades, maledes och smältes enzymatiskt. Efter filtrering och centrifugering odlades de uppsamlade cellerna. Dessa celler var vidhäftande, hade MSC-liknande morfologi och visade anmärkningsvärd klonogen förmåga. Vidare differentierade de sig till adipogena, kondrogeniska och osteogena släktlinjer, vilket visade deras multipotens. Sammanfattningsvis visar studien isolering och expansion av MSC, som visar potential inom vävnadsteknik och regenerativ medicin.
Introduction
Mesenkymala stamceller (MSC) är en attraktiv kandidat för cellbaserade terapier inom regenerativ medicin 1,2. De kan skördas från en mängd olika vävnadskällor såsom benmärg, navelsträng, placenta, tandmassa och subkutan fettvävnad3. Eftersom tillgången på stamceller hos vuxna är begränsad och deras isoleringsförfarande ofta är invasivt (vilket resulterar i sjuklighet på donatorstället) är det önskvärt att ha en alternativ stamcellskälla som kan kringgå dessa utmaningar.
Knäleden är en depå av olika celltyper, såsom infrapatellar fettkudde-härledda MSC, synovialmembran-härledda MSC, synovialvätske-härledda MSC, ligamentfibroblaster, ledade kondrocyter, etc 4,5,6. Dessa celler har potential att utforskas i stor utsträckning inom muskuloskeletal vävnadsteknikbaserad forskning. Därför kan knäleden vara en möjlig och pålitlig källa till flera typer av MSC: er. Fettdepå i knäleden, känd som infrapatellär fettkudde (IFP) eller Hoffas fettkudde, är ett lovande och alternativt val av MSC-depå. IFP är en relativt lättillgänglig och kliniskt erhållbar källa till MSC, eftersom den rutinmässigt resekteras och kasseras som kirurgiskt avfall under knäartroskopi eller öppen knäkirurgi. Avlägsnande av IFP är förknippat med minimal sjuklighet på donatorplatsen, vilket också gör det till en attraktiv vävnadskälla. Även om MSC från IFP (IFP-MSC) har en liknande fenotypisk profil har de förbättrad klonogen potential jämfört med benmärgshärledda mesenkymala stamceller (BM-MSC)6 och bättre proliferativ kapacitet jämfört med subkutana fett-härledda stamceller (ADSC)7. Intressant nog, jämfört med synovialvätske-härledda MSC (SF-MSC), förlorar IFP-MSC inte sin proliferativa kapacitet vid sena passager, och fördubblingstiden ökar inte heller vid sena passager. Detta tyder på att IFP-MSC under cellutvidgning kan uppnå ett tillräckligt stort antal celler för in vitro-vävnadstekniska tillämpningar utan att kompromissa med deras spridningshastighet8. Nya studier har också föreslagit att IFP-MSC har överlägsen kondrogen differentieringspotential jämfört med benmärgshärledda MSC (BMSC) och fett-härledda MSC (ADSC), troligen på grund av deras anatomiska närhet till ledbrosk, vilket indikerar deras lämplighet för broskvävnadsteknik 6,7,9,10. Dessutom har de också åldersoberoende osteogen differentieringspotential11. Intraartikulär injektion av IFP-MSC har visat sig minska smärta och förbättra knäledsfunktioner hos patienter med artros (OA)12,13. Vidare har starka immunsuppressiva svar och förbättrade immunmodulerande egenskaper hos IFP-MSC i närvaro av inflammatoriska cytokiner under patologiska tillstånd också rapporterats6.
IFP-MSC är en lovande och alternativ källa till MSC; emellertid är deras terapeutiska fördel inom vävnadsteknik och regenerativ medicin relativt mindre utforskad. De befintliga studierna på IFP-MSC har i stor utsträckning använt celler från mänskliga givare. Bland dessa har några nyligen genomförda studier undersökt IFP-MSC från friska mänskliga givare (icke-artritiska patienter, i åldern 17-60 år)6,14, medan de flesta studierna har använt IFP-MSC från åldrade patienter som genomgår total knäbyteskirurgi (sjuka patienter, ålder 70-80 år). Eftersom både ålder och sjukdom är kända för att förändra stamcellernas normala funktion (minskat antal och förlust av funktionell potential) kan detta potentiellt leda till inkonsekvenser i resultatet av de MSC-baserade studierna 7,15,16,17. Utöver detta utgör användningen av IFP-MSC från patienter med patofysiologiska tillstånd (t.ex. artrit och fetma) också svårigheter att förstå de grundläggande egenskaperna hos friska celler in vitro och fungerar därmed som en begränsande faktor i utvecklingen av MSC-baserade terapier. För att övervinna dessa problem är användningen av IFP-MSC från friska givare avgörande. Eftersom tillgången till en frisk mänsklig donator är utmanande kan djurmodeller vara ett bättre alternativ. I detta avseende finns det några studier där IFP har isolerats från möss18. På grund av fettkuddens lilla storlek hos normala möss har dock fettvävnader från flera djur kombinerats för att få tillräckligt med vävnad för att utföra detaljerade experimentella procedurer19. Därför finns det ett behov av en stor djurmodell, som kan uppfylla kravet på det högre antalet celler och samtidigt följa 3R-principerna (förfina, ersätta och minska) i djurförsök20. Användningen av stora djur har betydande konsekvenser i translationell forskning. Specifikt, inom muskuloskeletal vävnadsteknik, har en rad stora djur som hundar, grisar, får, getter och hästar undersökts21. Get (Capra aegagrus hircus) är ett utmärkt val av stora djur eftersom dess kvävningsled har den närmaste anatomin till den mänskliga knäleden22,23,24. Den subkondrala bentrabekulära strukturen och subkondrala bentjockleken hos getter liknar människor, och andelen brosk till ben rapporteras också vara nära människor21. Dessutom har getter tämjts i stor utsträckning över hela världen, vilket gör dem lättillgängliga när de är skelettmogna. Vidare har låga underhållskostnader och enkel hantering gjort dem till en attraktiv djurmodell för forskning22.
I denna studie demonstreras ett enkelt protokoll för isolering av IFP-MSC från kvävningsleden av Capra aegagrus hircus (get) och in vitro-odlingsförhållanden för deras expansion och differentiering. De isolerade cellerna är vidhäftande, har MSC-liknande morfologi, bildar CFU-F-kolonier (kolonibildande enhetsfibroblast) och har adilogen, kondrogen och osteogen differentieringspotential. Därför visar IFP-MSC potential som en alternativ källa till MSC för biomedicinska applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet är baserat på isolering av IFP-MSC från getter. Get IFP och blod samlades in från ett lokalt slakteri. Eftersom sådana vävnadssamlingar ligger utanför en institutionell djurförsöksetisk kommittés ansvarsområde krävdes inget etiskt godkännande.
1. Isolering av IFP-MSC från den femorotibiala leden i getknäet
- Samla get femorotibial led (prov) som omfattar ~ 15 cm var och en av lårbens- och tibialregionerna i bakbenen. Lägg omedelbart provet i en steriliserad uppsamlingsbox och förvara det vid 4 °C för transport till laboratoriet för vidare bearbetning. Bearbeta proverna aseptiskt i ett biosäkerhetsskåp med hjälp av steriliserade kirurgiska verktyg under hela proceduren (figur 1, steg 1).
- Placera provet på en 150 mm petriskål och skölj det noggrant med autoklaverad fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletterad med antibiotika (5 μg/ml amfotericin B, 200 U/ml penicillin-streptomycin och 50 μg/ml ciprofloxacin) för att undvika kontaminering. Se alltid till att provet hålls hydratiserat med PBS.
- Undersök noggrant de anatomiska regionerna i provet. För att underlätta åtkomsten till ledkapseln, se till att de extra vävnaderna från båda de långa benen är helt borttagna (figur 1, steg 2).
- För att uppnå detta, håll först lårbenets ändyta med en hand och skär med en sax i längdriktningen mot leden. Ta bort de omgivande musklerna och fettvävnaden från benet under processen. Var försiktig så att vävnaden som omger den omedelbara ledkapseln förblir ostörd initialt.
- På samma sätt gör du ett annat snitt vid tibialänden av provet och tar bort musklerna och fettvävnaden från tibialbenet. Se till att båda de långa benen är helt exponerade och att ledkapseln är tydligt synlig efter detta steg (figur 1, steg 3).
- Gör sedan ett snitt från vardera sidan av synoviummembranet för att skära upp ledleden (figur 1, steg 4). Skär loss patella från både synoviummembranet och patellarbandet med en ny sats steriliserad sax och pincett. Förvara omedelbart den separerade patellaen i en petriskål som innehåller PBS (figur 1, steg 5).
- Ta bort hela fettkudden som finns på insidan av patella med sax och pincett och samla fettdynan i en annan färsk petriskål (figur 1, steg 6). Hacka den uppsamlade fettkudden med en skalpell. Inkludera andra kirurgiska verktyg (t.ex. sax eller kirurgiska blad) efter behov för att få minsta möjliga fettbitar / segment på ~ 2-3 mm.
OBS: Bra mincing är avgörande för att resultera i ett bra utbyte av celler. Håll alltid vävnaden hydratiserad och låt den inte torka i något skede av isoleringsproceduren. - Överför den malet vävnaden med en spatel till ett 50 ml centrifugrör och tvätta den med PBS kompletterad med antibiotika vid rumstemperatur (RT) i 15 minuter i en provrörsblandare. Upprepa tvättsteget 3x, 15 min vardera.
- För enzymatisk matsmältning, inkubera den malet vävnaden (~ 5 g) i Dulbeccos Modified Eagle's Media (DMEM låg glukos) som innehåller 1,5 mg / ml typ II kollagenas (20 ml) och kompletteras med 2% FBS vid 37 ° C i 12-16 timmar.
OBS: Utför matsmältningen i en provrörsblandare vid ~ 15 varv per minut (RPM). - Aspirera försiktigt den smälta vävnaden och filtrera den genom en cellsil (70 μm) för att avlägsna osmält vävnad. Centrifugera filtratet i ett 15 ml centrifugrör vid 150 x g i 5 minuter. Ta bort supernatanten och tvätta pelleten med DMEM låg glukos minst 2x.
OBS: Häll den smälta vävnaden långsamt i silen för att undvika spill. Använd ett centrifugrör med låg volym (15 ml) för att få en bra pellets. - Återsuspendera den erhållna cellpelleten i komplett DMEM-media (DMEM-låg glukos kompletterad med 10% FBS och antibiotika [2,5 μg / ml amfotericin, 100 U / ml penicillin-streptomycin och 25 μg / ml ciprofloxacin]), kallad expansionsmedia i protokollet i de efterföljande stegen.
- Frö cellerna på 150 mm petriskålar och odla dem i expansionsmediet kompletterat med 5 ng / ml basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) och 50 μg / ml 2-fosfo-L-askorbinsyra trinatriumsalt. Inkubera cellerna vid 37 °C i en 5% CO 2-inkubator så att cellerna kan fästa och sprida sig. Övervaka cellernas bifogning och tillväxt dagligen.
2. Underhåll och expansion av isolerade celler
- Byt media var 3: e dag tills cellerna blir sammanflytande. Tillsätt färskt 5 ng / ml bFGF och 50 μg / ml 2-fosfo-L-askorbinsyra trinatriumsalt direkt till petriskålen varje gång mediet byts. Efter att cellerna blivit 80%-90% sammanflytande, subkulturera cellerna.
Ta bort de enheter som inte följer reglerna under varje medieändring. Om oljedroppar ses efter 3 dagars inkubation, tvätta cellerna med PBS 1x och tillsätt sedan färskt media till petriskålen. Fortsätt med PBS-tvätt innan varje mediebyte tills oljedropparna är helt borttagna. - Subodling av celler: Ta bort expansionsmediet från petriskålen och tvätta cellerna 1x med PBS. Tillsätt 4 ml 0,25% trypsin/EDTA i skålen och inkubera cellerna vid 37 °C i en 5% CO 2-inkubator i 4 minuter.
OBS: Sammanflöde (80% -90%) uppnås inom 7 dagar. Fördela trypsin/EDTA-lösningen jämnt över hela petriskålens yta under trypsinisering. - Lossa cellerna genom att knacka på plattan på sidan och observera under ett mikroskop för att bekräfta att alla celler är lossnade. Neutralisera trypsin efter tillsats av en lika stor volym (4 ml) expansionsmedia.
- Samla de dissocierade cellerna med hjälp av en pipett i ett nytt 15 ml polypropenrör och centrifugera vid 150 x g i 5 minuter vid RT. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i önskad volym expansionsmedium.
- Räkna cellerna med hjälp av standardcellräkningsmetoden och subkulturen i 150 mm petriskålar med en sådddensitet på 1 x 104 celler/cm2 för vidare expansion. För alla analyser, använd ett sammanflytande monolager av celler med passagenummer P2-P5.
OBS: Kryobevara överskottscellerna.
3. Utvärdering av den klonogena förmågan hos IFP-MSC med hjälp av kolonibildande analys (CFU-F)
- För CFU-F-analys, frö cellerna i expansionsmedia i en 6-brunns vävnadsodlingsplatta med en sådddensitet på 50-100 celler / cm2. Lägg till media för att få en slutlig volym på 3 ml.
OBS: Optimera cellkoncentrationen för analyser och behandling. - Odla cellerna i 12 dagar vid 37 °C i en 5% CO 2-inkubator under standardodlingsförhållanden så att cellerna kan bilda kolonier. Byt media var 3: e dag. Var försiktig när du byter media.
- Efter 12 dagar, skölj kolonierna 1x med PBS och fixa dem med 20% metanol i 20 min vid RT. Färga kolonierna med kristallviolett färgämne (0,5% [w / v] i 20% metanol) i 20 min vid RT. Räkna de enskilda kolonierna med ett inverterat mikroskop.
OBS: En koloni definieras som ett kluster med mer än 50 celler.
4. Differentieringspotential för IFP-MSC
- Inducera adipogen differentiering av IFP-MSC
- För att inducera adipogenes, frö cellerna med en densitet av 25 x 103 celler / cm2 i en 24-brunns vävnadsodlingsplatta. Tillsätt media för att få en slutlig volym på 500 μl. Odla cellerna vid 37 °C i en 5% CO 2-inkubator.
- En dag efter sammanflödet, ersätt expansionsmediet med 500 μL adipogenic differentieringsmedier. Det tar ungefär 2 dagar för cellerna att nå sammanflöde.
- Förbered det adipogena differentieringsmediet genom att komplettera expansionsmedia (DMEM + 10% FBS + 2,5 μg / ml amfotericin, 100 U / ml penicillin-streptomycin och 25 μg / ml ciprofloxacin) med 25 mM D (+) -glukos, 10 μg / ml insulin, 1 μM dexametason och 100 μM indometacin.
OBS: Differentieringsmedier är instabila vid 4 ° C efter 1 månad; förbered därför media när och när det behövs. - Betrakta cellerna som odlas i expansionsmediet kompletterat med 25 mM D (+) glukos som oinducerade kontroller. Byt media var 3: e dag i 14 dagar. I slutet av de 14 dagarna, tvätta cellerna 1x med PBS. Fixera cellerna med neutralt buffrat formalin (NBF; 4 % formaldehyd i PBS) i 15 min vid 4 °C.
- Efter fixering, tvätta brunnarna 1x med destillerat vatten och inkubera sedan cellerna med 60% isopropanol i 5 min vid RT. Efter avlägsnande av isopropanol, färga lipiddropparna genom att inkubera cellerna med 500 μL av arbetslösningen av Oil Red O-färgämne i 5 minuter vid RT. Tvätta brunnarna 1x med destillerat vatten för att ta bort det obundna färgämnet och avbilda cellerna med ett inverterat mikroskop.
OBS: Bered stamlösningen av Oil Red O (ORO) genom att lösa 300 mg ORO i 100 ml 99% isopropanol. För att förbereda arbetslösningen, blanda tre delar lager ORO och två delar destillerat vatten och låt det blandas vid RT i 10 min. Filtrera blandningen med 0,2 μm filterpapper. Arbetslösningen är klar att användas. Stamlösningen kan beredas och förvaras vid RT i 1 månad i mörker, medan arbetslösningen måste vara nyberedd före varje användning/färgning.
- Inducera kondrogen differentiering av IFP MSC
- Isolering av getplasma:
- Bered 3,4% (w/v) natriumcitrat i destillerat vatten. Tillsätt 5 ml av den beredda natriumcitratlösningen till ett 50 ml centrifugrör.
- Samla 45 ml av det nyligen isolerade getblodet i samma rör. Luta omedelbart röret för att blanda blodet med natriumcitrat noggrant för att förhindra koagulering och transportera det till laboratoriet vid 4 °C.
- Centrifugera det uppsamlade getblodet vid 1000 x g i 20 minuter vid 4 °C. Överför supernatanten (plasma) till ett nytt rör inuti ett biosäkerhetsskåp. Filtrera plasma genom 0,2 μm filter, alikvot och förvara vid -20 °C för vidare användning.
OBS: Håll temperaturen 2-8 °C medan du hanterar proverna. Det är viktigt att minimera plasmaens frys-tina cykler.
- Odla de expanderade cellerna till 80% -90% sammanflöde, dissociera cellerna med trypsin / EDTA-lösning och pellet ner cellerna vid 150 x g i 5 min i ett 15 ml centrifugrör. Återsuspendera pelleten i getplasma med en densitet av 2 x 106 celler per 50 μl plasmalösning.
- Tillsätt en droppe plasmainnehållande celler (50 μl) på en steriliserad 90 mm petriskål och tillsätt sedan kalciumklorid i en slutlig koncentration av 0,3 % (vikt/volym). Blanda väl för att tillverka tvärbunden plasmahydrogel.
- Inkubera den tillverkade hydrogelen vid 37 °C i 40 minuter. Efter inkubation överför hydrogelerna till 24-brunns vävnadsodlingsplattor innehållande kondrogena medier.
- Bered kondrogena medier genom att komplettera DMEM-låg glukoshalt med 10 mM 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazineetansulfonsyra (HEPES), 1,25 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 1 mM prolin, 50 μg/ml 2-fosfo-L-askorbinsyratrinatriumsalt, 100 nM dexametason, 1x insulin, transferrin, natriumselenit + linolsyra-BSA (ITS+1), antibiotika (2,5 μg/ml amfotericin, 100 U/ml penicillin-streptomycin och 25 μg/ml ciprofloxacin), och 10 ng/ml transformerande tillväxtfaktor- β1 (TGF-β1).
- Hydrogelerna odlade i kompletta DMEM-medier (DMEM låg glukos med 10% FBS och antibiotika [2,5 μg / ml amfotericin, 100 U / ml penicillin-streptomycin och 25 μg / ml ciprofloxacin]) utan TGF-β1 betraktas som oinducerade kontroller. Byt media var 3: e dag i 14 dagar.
- Efter 14 dagars kondrogen differentiering av celler i plasmahydrogeler, tvätta hydrogelerna med PBS 3x i 5 min vardera och fixera sedan proverna i NBF i 3 timmar.
VARNING: Formaldehyd är potentiellt cancerframkallande och kan orsaka irritation i näsa, hals och lungor vid inandning. Utför alla procedurer relaterade till formaldehyd i en rökhuv. - Ta bort NBF, tvätta hydrogelerna med PBS 3x i 5 min vardera och inkubera sedan i 35% (w/v) sackaros vid RT över natten så att lösningen kan absorberas helt i proverna. Acklimatisera hydrogelerna i optimal skärtemperatur (OCT) förening i 3 timmar. Bädda in proverna i OCT-förening med silikonformar under flytande kväve.
- Skär proverna med en tjocklek av 10-12 μm på gelatinbelagda glasskivor med en kryotom och förvara dem vid -20 °C för framtida bruk. För att undersöka närvaron eller avsättningen av den extracellulära matrisen efter kondrogen differentiering, färga sektionerna med Alcian Blue och Safranin-O-färgämne, som binder till sulfaterade glykosaminoglykaner.
OBS: För att förbereda Alcian Blue-färgämnet, lös upp 1 g Alcian Blue-färgämne i 100 ml 0,1 N HCl och blanda noggrant i en provrörsblandare över natten. Lösningen kan förvaras på RT i 1 månad i mörkret. För att förbereda Safranin-O-färgämne, lös upp 0,1 g Safranin-O-färgämne i 100 ml destillerat vatten och blanda noggrant i en provrörsblandare över natten. - För Alcian Blue-färgning, tvätta hydrogelsektionerna 1x med destillerat vatten i 5 minuter. För att fixa sektionerna, tillsätt 4% NBF till bilderna och inkubera i 30 min.
- Tvätta sektionerna 1x med destillerat vatten i 5 min och sedan 2x med 0,1 N HCl i 30 s vardera. Ta bort HCl och torka försiktigt bilderna med silkespapper. Tillsätt den beredda Alcian Blue-fläcken i sektionerna och inkubera i 30 minuter vid 37 °C i en fuktad kammare.
- Tvätta det obundna färgämnet med 0,1 N HCl och destillerat vatten i 3 min. Dehydrera sektionerna i absolut etanol, rensa dem i xylen och montera slutligen de färgade sektionerna i ett hartsartat medium för avbildning.
- För Safranin-O-färgning, tvätta hydrogelsektionerna med destillerat vatten 1x i 5 min. För att fixa sektionerna, tillsätt 4% NBF till bilderna och inkubera i 30 min. Tvätta sektionerna 1x med destillerat vatten i 5 min och doppa sedan bilderna i 1% ättiksyra i 10-15 s. Torka bilderna försiktigt med silkespapper.
- Tillsätt beredd Safranin-O-färgämne till sektionerna och inkubera i 10 minuter vid RT. Tvätta det obundna färgämnet med 100% etanol. Doppa bilderna i 100% etanol i 5 min. Lufttorka rutschkanorna, rensa dem i xylen och montera slutligen de färgade sektionerna i ett hartsartat medium för avbildning.
- Isolering av getplasma:
- Inducera osteogen differentiering av IFP MSC
- För att inducera osteogen differentiering, trypsinisera cellerna, som nämnts tidigare (steg 2.2.). Frö cellerna med en densitet av 3 x 103 celler/cm2 i en 24-brunns vävnadsodlingsplatta. Tillsätt media för att få en slutlig volym på 500 μl. Odla cellerna vid 37 °C i en 5% CO 2-inkubator. 1 dag efter sådd, ersätt expansionsmediet med 500 μL osteogent differentieringsmedium.
- Förbered det osteogena mediet genom att komplettera expansionsmediet (DMEM + 10% FBS +2,5 μg / ml amfotericin, 100 U / ml penicillin-streptomycin och 25 μg / ml ciprofloxacin) med 25 mM D (+)-glukos, 10 nM dexametason, 10 mM β-glycerofosfat, 50 μg / ml 2-fosfo-L-askorbinsyra trinatriumsalt och 10 nM vitamin D3.
OBS: Cellerna odlade i expansionsmedier kompletterade med 25 mM D (+) glukos anses vara oinducerade kontroller. - Byt osteogent medium var 3: e dag i 14 dagar eller 28 dagar. I slutet av 14 dagar mäter du omfattningen av osteogenes genom alkalisk fosfatas (ALP) färgning.
OBS: För att förbereda substratet för ALP-färgning, lös upp en 5-Bromo-4- Klor-3-Indolylfosfat (BCIP) / Nitroblue Tetrazolium (NBT) tablett i 10 ml destillerat vatten i ett 15 ml centrifugrör. Låt tabletten lösas upp helt. Substratlösningen är klar att användas. Eftersom substratlösningen inte kan lagras under en längre tid, baserat på behov, bryt tabletten i hälften och lös upp den i 5 ml destillerat vatten. För att förbereda permeabiliseringsbufferten, tillsätt Tris-buffert (100 mM) och magnesiumklorid (5 mM) till destillerat vatten. Tillsätt Triton X100 (0,1%) till lösningen och låt den lösas upp. Justera lösningens pH till 9,25-9,75. - För ALP-färgning, efter 14 dagars induktion, ta bort mediet och tvätta cellerna med PBS. Fixa cellerna med NBF (4%) i 1 min. Tvätta cellerna med PBS och genomträng med den beredda lysbufferten i 2-3 minuter.
- Tillsätt 500 μl av den beredda substratlösningen till cellerna och låt den inkubera i 15 minuter till 1 timme, beroende på uttrycksnivån. Kontrollera utvecklingen av lila / blå färg däremellan.
- Ta bort substratlösningen och tvätta med destillerat vatten. Avbilda de färgade cellerna med ett inverterat mikroskop.
- I slutet av 28 dagar mäter du omfattningen av förkalkning efter osteogen induktion genom Alizarin Red-S-färgning.
OBS: För att bereda Alizarin Red-S-färgningslösningen (40 mM), lös upp 2 g Alizarin Red-S i 100 ml destillerat vatten och justera pH till 4,1-4,3 med HCl ellerNH4OH. Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm membran och förvara vid 4 °C i mörker. Lösningens pH är viktigt; Därför rekommenderas det att antingen göra en ny lösning eller att mäta lösningens pH igen om det är mer än 1 månad gammalt. - För Alizarin Red-S-färgning, efter 28 dagars induktion, ta bort mediet och tvätta cellerna 1x med kall PBS. Fixera cellerna med 70 % etanol i 1 timme vid 4 °C.
- Ta bort fixeringsmedlet och tvätta cellerna 2x med destillerat vatten. Ta bort vattnet helt och tillsätt 1 ml Alizarin Red-S-lösning till varje brunn.
- Inkubera cellerna med lösningen i 1 h vid RT och avbilda cellerna med hjälp av ett inverterat mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolering av IFP-MSC från getens femorotibiala led
Stegen som är involverade i isoleringen av IFP-MSC från kvävningsleden hos en get visas i figur 1. Fettkudden som finns i den inre icke-artikulerande ytan av patella avlägsnades, maledes och smältes enzymatiskt. IFP-MSC:erna isolerades framgångsrikt och odlades in vitro (figur 2A).
Expansion och klonogen förmåga hos IFP-MSC
De isolerade cellerna odlades in vitro i expansionsmedier. Cellerna började fästa vid vävnadsodlingsplattan inom 12 timmar efter sådd och var mestadels runda i form vid dag 0. De var homogent vidhäftande till plattan och uppnådde långsträckt morfologi inom 24 timmar. Denna morfologi upprätthölls under hela kulturens varaktighet. Cellerna förökade sig effektivt i odling och blev 80%-90% sammanflytande inom 6 dagar efter expansion (figur 2A). Dessutom visade de isolerade cellerna klonogen kapacitet, bedömd genom kolonibildande enhetsfibroblastanalys (CFU-F) (figur 2B). Dessa resultat indikerar att de isolerade cellerna har effektiva proliferativa och självförnyande förmågor in vitro.
Differentieringspotential för IFP-MSC
För att karakterisera om de isolerade cellerna var multipotenta och hade karakteristiska egenskaper hos MSC, inducerades de att differentiera till flera släktlinjer. De isolerade cellerna, när de inducerades mot adipogen härstamning, producerade lipiddroppar, vilket kan observeras från ljusfältbilderna (figur 3A). Detta bekräftades ytterligare av Oil Red O-färgning på dag 14 och dag 21, vilket tyder på att dessa celler kan differentieras till adipocyter. Å andra sidan observerades inga synliga oljedroppar i cellerna odlade i frånvaro av adiloga inducerande faktorer (figur 3B,C).
För att bestämma den kondrogena potentialen hos de isolerade cellerna kapslades cellerna in i plasmahydrogel och fick differentieras till den kondrogena härstamningen. Som avbildas från bruttobilderna av plasmahydrogelen (figur 4A) verkade neotissue som bildades efter 14 dagar i den inducerade gruppen vit och blank (liknande ledbrosk), medan den i den oinducerade gruppen var blekvit och minskad glans observerades. Dessutom kunde cellerna i den inducerade gruppen utsöndra en av huvudkomponenterna i broskmatrisen (dvs. sulfaterade glykosaminoglykaner), vilket framgår av positiv histologisk färgning för Alcian Blue (Figur 4B) och Safranin O (Figur 4C). Däremot var hydrogelsektionerna från de oinducerade grupperna negativa för Safranin O och Alcian Blue-färgning. Dessa resultat indikerar tillsammans den kondrogena differentieringspotentialen hos MSC: erna endast i närvaro av kondrogena stimuli.
De isolerade cellerna visade också osteogen differentieringspotential. Efter 14 dagar och 21 dagar i odling observerades ingen spontan mineralisering (oinducerad grupp). Men när det inducerades med osteogena medier framgick mineralisering av den positiva färgningen för alkaliskt fosfatas (ALP) i slutet av 14 dagar (figur 5A). Dessutom, efter 28 dagars kultur i osteogena medier, visualiserades förkalkade avsättningar genom positiv Alizarin Red-S-färgning (Figur 5B). Dessa resultat visar att de isolerade cellerna från getinfrapatellär fettkudde, när de induceras, har potential att differentiera till adipogena, kondrogena och osteogena släktlinjer.
Figur 1: Schematisk för isolering av IFP-MSC från getknäets kvävningsled. Steg 1. Samla getknäprovet från slakteriet och fortsätt med dissektion i ett biosäkerhetsskåp; Steg 2. Undersök noggrant vävnadens anatomi och ta bort de omgivande musklerna och fettvävnaden; Steg 3. Utan att störa ledkapseln, ta bort musklerna och fettvävnaderna för att helt exponera både de långa benen (lårbenet och skenbenet); Steg 4. Gör ett snitt i synoviummembranet och skär upp ledleden för att exponera patella och trochleärt brosk; Steg 5. Ta bort patella från ledleden försiktigt, utan att störa infrapatellär fettkudde (IFP), och förvara den på en petriskål som innehåller PBS; Steg 6. Ta långsamt bort hela fettkudden från patella och förvara den i en färsk petriskål för malning och enzymatisk matsmältning. (a. Femur, b. Tibia, c. Patella, d. Trochlear brosk, e. Infrapatellar fettkudde). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Morfologi och klonogen potential hos IFP-MSC . (A) Mikrografer togs vid passage 3 med hjälp av ett inverterat ljusfältmikroskop med 10x förstoring. Omedelbart efter sådd (dag 0) förblev cellerna runda i form, vid dag 3 uppnådde de flesta cellerna långsträckt morfologi, och på dag 6 blev IFP-MSC: erna 80% -90% sammanflytande (Skalstång = 100 μm). (B) Representativa bilder (n = 3) av CFU-F-kolonier färgade med kristallviolett färgämne efter 12 dagars sådd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Adipogen differentiering av IFP-MSC. Den övre panelen indikerar mikrografer av oinducerade IFP-MSC: er, och den nedre panelen representerar IFP-MSC som induceras i den adipogena härstamningen. (A) Representativa ljusfältsbilder som visar bildandet av lipidvakuoler under adipogenes (skalstång = 100 μm). Representativa bilder av oljeröd O-färgning av lipiddroppar vid (B) dag 14 och (C) dag 21 av differentiering (skalstång = 20 μm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kondrogen differentiering av IFP-MSC. Den övre panelen indikerar hydrogelkonstruktioner / sektioner från oinducerad hydrogel, och bottenpanelen representerar hydrogel som utsätts för kondrogenes. (A) Bruttobilder av plasmahydrogelkonstruktioner efter 14 dagar i odling i frånvaro (oinducerad) eller närvaro (inducerad) av kondrogena medier kompletterat med TGF-β1. Representativa bilder av 10 μm sektioner hydrogel färgade med sGAG-bindande färgämne (B) Alcian Blue (blå) och (C) Safranin O (röd) (Skalstreck = 100 μm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Osteogen differentiering av IFP-MSC. Den övre panelen indikerar oinducerade celler, och den nedre panelen indikerar celler inducerade med osteogena medier. Mikrografer och representativa bilder av IFP-MSC färgade med (A) BCIP-NBT (alkaliskt fosfatas) efter 14 dagar och (B) Alizarin Red-S (kalciumavsättning) efter 28 dagars differentiering (Skalstång = 100 μm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll har en enkel, pålitlig och reproducerbar metod för isolering av MSC från get-IFP tillhandahållits. Celler isolerade med denna metod har framgångsrikt använts i våra tidigare studier för vävnadsregenerering in vitro. Det observerades att de isolerade cellerna var proliferativa, reagerade på olika tillväxtfaktorer och behöll sin biologiska aktivitet när de såddes på elektrospunfibrer och byggnadsställningar25,26. Dessutom observerades att ett stort antal högkvalitativa MSC kan erhållas och samodlas med kondrocyter i injicerbara hydrogeler för att konstruera ledbrosk in vitro27,28,29. Medan proceduren för dissektion och isolering av celler är enkel, finns det några steg som måste följas noggrant för framgångsrik isolering och expansion av MSC från IFP. För det första, eftersom det inte är möjligt att upprätthålla verkligt aseptiska förhållanden när provet tas från slakteriet, rekommenderas det att torka den yttre vävnaden med 70% etanol för att sterilisera vävnaden innan isoleringsproceduren påbörjas. Nästa viktiga steg är att dissekera fettkudden från knäleden. IFP ligger under patella i knäleden. Den proximala änden av IFP är fäst vid den distala änden av patella30,31. Därför blir det mycket viktigt att identifiera den korrekta platsen för patella medan du utför isoleringsproceduren. Därefter, när IFP artikulerar med trochlearbrosket i lårbenet och är täckt med synoviummembranet30,31, är det nödvändigt att göra ett snitt mot synoviummembranet för att skära upp knäleden. Det är också viktigt att observera den allmänna hälsan hos den uppsamlade infrapatellarna fettkudden. Eftersom IFP består av adipocyter (celler) och fettbindvävnad, såsom kollagen och glykosaminoglykaner, hakas vävnaden och smälts med hjälp av kollagenasenzym för att frigöra cellerna 9,32. De flytande adipocyterna separeras genom centrifugering med långsam hastighet för att ha en homogen kultur av MSC. De återstående adipocyterna i den stromala vaskulära fraktionen måste avlägsnas från vävnadsodlingsplattan vid varje mediebyte genom att tvätta cellmonolagret med PBS innan de tillsätts till nya medier. Detta steg måste fortsätta tills alla synliga adipocyter har tagits bort. Det föreslås att återföra cellerna i en ny platta efter att P0-celler når sammanflödet för att bli av med de återstående adipocyterna, som kan ha fäst vid plattväggen och är svåra att ta bort. Slutligen, eftersom getproverna mestadels erhålls från ett slakteri, är det svårt att spåra getens exakta ålder, och därför, medan cellerna isoleras, måste variationen mellan proverna noggrant observeras och dokumenteras. Det föreslås att karakterisera cellerna för självförnyelse (CFU-F), proliferation och differentieringspotential efter varje isolering innan de används för olika applikationer och mekanistiska studier. På grund av kravet på ett stort antal celler i cellbaserade vävnadstekniska applikationer blir odlingsförhållandena som underlättar spridning, fördröjer åldrande och upprätthåller cellernas stamhet centralt viktiga. Det observerades att MSC odlade i 2-fosfo-L-askorbinsyra trinatriumsalt (PAA) och basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) visade en ~ 42-faldig ökning av deras antal jämfört med MSC odlade i bFGF ensam. Dessutom minskade sambehandlingen av PAA och bFGF produktionen av reaktiva syrearter (på grund av deras antioxidantegenskaper) och åldrande i stamceller. Därför är användningen av PAA under in vitro-expansion av MSC önskvärd33.
Medan enzymatisk matsmältning av vävnader används universellt och är en effektiv metod för att isolera MSC, är användningen av enzymer som kollagenaser tidskrävande och dyr34. I den aktuella studien tog den fullständiga matsmältningen av vävnaden med kollagenas 12-16 timmar (över natten), vilket kan leda till minskad livskraft eller förändrad ytfenotyp hos celler35. Därför kan metoden ytterligare optimeras för att minska varaktigheten av kollagenasbehandling för vävnadssmältning. Alternativt kan en enzymfri explantodlingsmetod som används för isolering av fett-härledda MSC från lipoaspirater eller inguinal fettkuddar också undersökas för isolering av IFP-MSCs34,36,37.
IFP-MSC, på grund av deras förmåga att differentiera sig till kondrogeniska, adipogena och osteogena släktlinjer har stor terapeutisk potential. Tidigare rapporter har visat att IFP-MSC uppvisar bättre kondrogen potential än andra stamceller 6,7,9,10. Därför har IFP-MSC fått intresse och anses vara en bättre kandidat för cellbaserad terapi för reparation av broskdefekter och lindring av brosknedbrytning vid artros. I en preklinisk studie resulterade samtidig leverans av IFP-MSC med brosk extracellulära matriskomponenter genom intraartikulär injektion i förbättrad broskregenerering vid osteokondrala defekter38. På liknande sätt ledde intraartikulär injektion av IFP-MSC i kaninartros (OA) -modellen till en minskning av följande sjukdomsparametrar: brosknedbrytning, osteofytbildning, subkondral benförtjockning och synovit39. Dessutom har resultat från en tidigare rapporterad randomiserad klinisk studie13 och en nyligen publicerad öppen fas 1-klinisk prövning40 visat att intraartikulära injektioner av IFP-MSC hos patienter med knäartros är säkra och resulterar i minskning av smärta och förbättring av ledfunktionen, vilket indikerar deras lovande terapeutiska potential för att förbättra knä-OA-relaterade komplikationer. IFP-MSC har också visat sig utveckla förstärkta immunmodulerande egenskaper i närvaro av proinflammatoriska signaler genom att underlätta nedbrytningen av en inflammatorisk regulator, substans P (SP), vilket leder till en minskning av proinflammatoriska och katabola molekyler och som en följd av detta förbättrad behandling av inflammation och fibros av synovium och IFP6 . Ännu viktigare är att IFP-MSC som bearbetades under regulatoriska förhållanden visade bättre spridning, differentieringskapacitet och immunmodulerande egenskaper jämfört med standard in vitro-odlingsförhållanden, vilket visar deras potential för klinisk framgång när de används för mesenkymal stamcell (MSC) -baserad terapi41.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll isoleringen av infrapatellar fat pad (IFP) -härledda mesenkymala stamceller (MSC) från getkvävningsled genom enzymatisk matsmältning och deras upprätthållande i odling. De isolerade cellerna har proliferativ och självförnyelsepotential och kan differentieras till adilogen, osteogen och kondrogen härstamning. IFP-MSC är en lovande källa till MSC och har translationell potential för regenerativa medicinska applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
SH erkänner stöd från Institute Post-Doctoral Fellowship of IIT Kanpur och SYST-bidrag från DST (SEED Division) (SP/YO/618/2018). AM erkänner Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) för ett institutstipendium. DSK erkänner Gireesh Jankinaths professur och institutionen för bioteknik, Indien, för finansiering (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH och DSK tackar Mehta Family Center for Engineering in Medicine vid IIT-Kanpur för deras generösa stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422-10G | 10 mM |
| 0.25% Trypsin- 0.02% EDTA | Hi-Media | TCL049 | |
| 15-mL centrifuge tube | Corning | ||
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | 50 µg/mL |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | HiMedia | TCL021-50ml | 10 mM |
| 50-mL centrifuge tube | Corning | ||
| Alcian Blue | Hi-Media | RM471 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Alizarin Red S | S D Fine-Chem Limited | 26048-25G | For calcium deposition |
| Amphotericin B | HiMedia | A011 | 2.5 µg/mL |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Sino Biologicals | 10014-HNAE | 5 ng/mL |
| BCIP/NBT ALP Substrate | Sigma | B5655-5TAB | For ALP staining |
| Biological safety cabinet | |||
| BSA | HiMedia | MB-083 | Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL ) |
| Cell strainer | HiMedia | TCP-182 | 70 µm |
| Centrifuge | REMI | ||
| Ciprofloxacin | RANBAXY LAB. Limited | B17407T1 | 2.5 µg/mL |
| Crystal Violet | S D Fine-Chem Limited | 42555 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.94925.0521 | 25 mM |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 µM |
| DMEM LG | SIGMA | D5523 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FBS | Gibco | 10270 | Long name: Fetal Bovine Serum |
| Formaldehyde solution 37%-41% | Merck | 61780805001730 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 µM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | 10 µg/mL |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS 100 | ||
| ITS + 1 | Sigma-Aldrich | I2521-5mL | Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA |
| L-Proline | HiMedia | TO-109-25G | 1 mM |
| Magnesium chloride | Merck | 61751605001730 | For lysis buffer |
| Methanol | Meck | 1.07018.2521 | |
| Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Thermoscientific | ||
| MUSE Cell analyser | Merck Millipore | For cell counting | |
| OCT compound | Tissue-Tek | 4583 | Long name: Optimal Cutting Temperature |
| Oil Red O dye | S D Fine-Chem Limited | 54304 | For lipid vacuole staining |
| Penicillin-Streptomycin | HiMedia | A007 | 100 U/mL |
| Petri dishes (150 mm and 90 mm) | NEST | ||
| Safranin O | S D Fine-Chem Limited | 50240 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C3434 | 3.4 % (w/v) |
| Sterile scissors, forceps and scalpels | For isolation of IFP-MSC | ||
| Sucrose | Merck | 1.94953.0521 | 35 % (w/v) |
| TGF-β1 | Sino Biologicals | Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL) | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Thermoscientific | ||
| Tris buffer | Merck | 61771405001730 | For lysis buffer |
| Triton X100 | S D Fine-Chem Limited | 40632 | For lysis buffer |
| Type II collagenase | Gibco | 17101015 | 1.5 mg/mL |
| Vitamin D3 | Sigma | C9756-1G | 10 nM |
| Well plates (6 -WP and 24-WP) | NEST |
References
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regenerative Medicine. 4 (1), 22 (2019).
- Guo, Y., Yu, Y., Hu, S., Chen, Y., Shen, Z. The therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cardiovascular diseases. Cell Death & Disease. 11 (5), 349 (2020).
- Ge, Z., Goh, J. C. H., Lee, E. H. Selection of cell source for ligament tissue engineering. Cell Transplantation. 14 (8), 573-583 (2005).
- Harvanová, D., Tóthová, T., Sarissky, M., Amrichová, J., Rosocha, J. Isolation and characterization of synovial mesenchymal stem cells. Folia Biologica. 57 (3), 119-124 (2011).
- Kouroupis, D., et al. Infrapatellar fat pad-derived MSC response to inflammation and fibrosis induces an immunomodulatory phenotype involving CD10-mediated Substance P degradation. Scientific Reports. 9 (1), 10864 (2019).
- Lopa, S., et al. Donor-matched mesenchymal stem cells from knee infrapatellar and subcutaneous adipose tissue of osteoarthritic donors display differential chondrogenic and osteogenic commitment. European Cells & Materials. 27, 298-311 (2014).
- Garcia, J., et al. Characterisation of synovial fluid and infrapatellar fat pad derived mesenchymal stromal cells: The influence of tissue source and inflammatory stimulus. Scientific Reports. 6 (1), 24295 (2016).
- Tangchitphisut, P., et al. Infrapatellar fat pad: an alternative source of adipose-derived mesenchymal stem cells. Arthritis. 2016, 4019873 (2016).
- Ding, D. -C., et al. Human infrapatellar fat pad-derived stromal cells have more potent differentiation capacity than other mesenchymal cells and can be enhanced by hyaluronan. Cell Transplantation. 24 (7), 1221-1232 (2015).
- Khan, W., Adesida, A., Tew, S., Andrew, J., Hardingham, T. The epitope characterisation and the osteogenic differentiation potential of human fat pad-derived stem cells is maintained with ageing in later life. Injury. 40 (2), 150-157 (2009).
- Koh, Y. G., et al. Mesenchymal stem cell injections improve symptoms of knee osteoarthritis. Arthroscopy. 29 (4), 748-755 (2013).
- Koh, Y. G., Choi, Y. J. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis. Knee. 19 (6), 902-907 (2012).
- Kouroupis, D., Willman, M. A., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell-based spheroids enhance their therapeutic efficacy to reverse synovitis and fat pad fibrosis. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 44 (2021).
- Stocco, E., et al. Infrapatellar fat pad stem cells responsiveness to microenvironment in osteoarthritis: from morphology to function. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 323 (2019).
- Hindle, P., Khan, N., Biant, L., Péault, B. The infrapatellar fat pad as a source of perivascular stem cells with increased chondrogenic potential for regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 77-87 (2017).
- Stolzing, A., Jones, E., McGonagle, D., Scutt, A. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (3), 163-173 (2008).
- Wu, C. L., Diekman, B. O., Jain, D., Guilak, F. Diet-induced obesity alters the differentiation potential of stem cells isolated from bone marrow, adipose tissue and infrapatellar fat pad: the effects of free fatty acids. International Journal of Obesity (2005). 37 (8), 1079-1087 (2013).
- Barboza, E., et al. Profibrotic infrapatellar fat pad remodeling without M1 macrophage polarization precedes knee osteoarthritis in mice with diet-induced obesity. Arthritis & Rheumatology. 69 (6), 1221-1232 (2017).
- Allen, M. J., Hankenson, K. D., Goodrich, L., Boivin, G. P., von Rechenberg, B. Ethical use of animal models in musculoskeletal research. Journal of Orthopaedic Research. 35 (4), 740-751 (2017).
- Moran, C. J., et al. The benefits and limitations of animal models for translational research in cartilage repair. Journal of Experimental Orthopaedics. 3 (1), (2016).
- Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11 (1), 19 (2016).
- Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
- Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. The Knee. 19 (4), 493-499 (2012).
- Bhutada, S. S., Sriram, M., Katti, D. S. Sulfated carboxymethylcellulose conjugated electrospun fibers as a growth factor presenting system for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 268, 118256 (2021).
- Waghmare, N. A., Arora, A., Bhattacharjee, A., Katti, D. S. Sulfated polysaccharide mediated TGF-β1 presentation in pre-formed injectable scaffolds for cartilage tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 193, 62-72 (2018).
- Arora, A., Mahajan, A., Katti, D. S. TGF-β1 presenting enzymatically cross-linked injectable hydrogels for improved chondrogenesis. Colloids & Surfaces B: Biointerfaces. 159, 838-848 (2017).
- Arora, A., Sriram, M., Kothari, A., Katti, D. S. Co-culture of infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cells and articular chondrocytes in plasma clot for cartilage tissue engineering. Cytotherapy. 19 (7), 881-894 (2017).
- Mahajan, A., Singh, A., Datta, D., Katti, D. S. Bioinspired injectable hydrogels dynamically stiffen and contract to promote mechanosensing-mediated chondrogenic commitment of stem cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (6), 7531-7550 (2022).
- Nakano, T., Wang, Y. W., Ozimek, L., Sim, J. S. Chemical composition of the infrapatellar fat pad of swine. Journal of Anatomy. 204 (4), 301-306 (2004).
- Sun, Y., Chen, S., Pei, M. Comparative advantages of infrapatellar fat pad: an emerging stem cell source for regenerative medicine. Rheumatology. 57 (12), 2072-2086 (2018).
- Han, W., et al. Infrapatellar fat pad in the knee: is local fat good or bad for knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 16 (4), 1-8 (2014).
- Bae, S. H., et al. L-ascorbic acid 2-phosphate and fibroblast growth factor-2 treatment maintains differentiation potential in bone marrow-derived mesenchymal stem cells through expression of hepatocyte growth factor. Growth Factors. 33 (2), 71-78 (2015).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Jing, W., et al. Explant culture: an efficient method to isolate adipose-derived stromal cells for tissue engineering. Artificial Organs. 35 (2), 105-112 (2011).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
- Toghraie, F., et al. Treatment of osteoarthritis with infrapatellar fat pad derived mesenchymal stem cells in Rabbit. The Knee. 18 (2), 71-75 (2011).
- Chen, H. -H., et al. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cell product for treatment of knee osteoarthritis: a first-in-human study with evaluation of the potency marker. Cytotherapy. 24 (1), 72-85 (2022).
- Kouroupis, D., Bowles, A. C., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. CD10/Neprilysin enrichment in infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cells under regulatory-compliant conditions: implications for efficient synovitis and fat pad fibrosis reversal. The American Journal of Sports Medicine. 48 (8), 2013 (2020).
