Summary
Infrapatellaire vetkussen mesenchymale stamcellen (IFP-MSC's) kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit de infrapatellaire vetschijf van het kniegewricht. Ze vermenigvuldigen zich goed in vitro, vormen CFU-F-kolonies en differentiëren in adipogene, chondrogene en osteogene afstammingslijnen. Hierin wordt de methodologie gegeven voor de isolatie, uitbreiding en differentiatie van IFP-MSC's van geitenstikselgewricht.
Abstract
De IFP, aanwezig in het kniegewricht, dient als een veelbelovende bron van MSC's. De IFP is een gemakkelijk toegankelijk weefsel omdat het routinematig wordt gereseceerd en weggegooid tijdens artroscopische procedures en knievervangende operaties. Bovendien wordt de verwijdering ervan geassocieerd met minimale morbiditeit op de donorplaats. Recente studies hebben aangetoond dat IFP-MSC's hun proliferatiecapaciteit niet verliezen tijdens in vitro expansie en een leeftijdsonafhankelijk osteogene differentiatiepotentieel hebben. IFP-MSC's bezitten een superieur chondrogene differentiatiepotentieel in vergelijking met van beenmerg afgeleide MSC's (BMSCs) en van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's). Hoewel deze cellen gemakkelijk te verkrijgen zijn bij oudere en zieke patiënten, is hun effectiviteit beperkt. Daarom is het gebruik van IFP-MSC's van gezonde donoren belangrijk om hun werkzaamheid in biomedische toepassingen te bepalen. Omdat de toegang tot een gezonde menselijke donor een uitdaging is, kunnen diermodellen een beter alternatief zijn om fundamenteel begrip mogelijk te maken. Grote dieren zoals honden, paarden, schapen en geiten spelen een cruciale rol in translationeel onderzoek. Onder deze zou de geit een voorkeursmodel kunnen zijn, omdat het verstikkingsgewricht van de geit de dichtstbijzijnde anatomie heeft bij het menselijke kniegewricht. Bovendien kan goat-IFP voldoen aan de hogere MSC-aantallen die nodig zijn voor weefselregeneratietoepassingen. Bovendien maken lage kosten, beschikbaarheid en naleving van de 3R-principes voor dieronderzoek ze een aantrekkelijk model. Deze studie toont een eenvoudig protocol voor het isoleren van IFP-MSC's van het verstikkingsgewricht van geiten en in vitro kweekomstandigheden voor hun expansie en differentiatie. De aseptisch geïsoleerde IFP van de geit werd gewassen, gehakt en enzymatisch verteerd. Na filtratie en centrifugatie werden de verzamelde cellen gekweekt. Deze cellen waren adherent, hadden MSC-achtige morfologie en vertoonden een opmerkelijk clonogene capaciteit. Verder onderscheidden ze in adipogene, chondrogene en osteogene afstammingslijnen, wat hun multipotentie aantoonde. Concluderend toont de studie de isolatie en uitbreiding van MSC's, die potentieel tonen in weefseltechnologie en regeneratieve geneeskundetoepassingen.
Introduction
Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn een aantrekkelijke kandidaat voor celgebaseerde therapieën in de regeneratieve geneeskunde 1,2. Ze kunnen worden geoogst uit verschillende weefselbronnen zoals beenmerg, navelstreng, placenta, tandpulp en onderhuids vetweefsel3. Aangezien de beschikbaarheid van stamcellen bij volwassenen echter beperkt is en hun isolatieprocedure vaak invasief is (wat resulteert in morbiditeit op de donorplaats), is het wenselijk om een alternatieve stamcelbron te hebben die deze uitdagingen kan omzeilen.
Het kniegewricht is een depot van verschillende celtypen, zoals infrapatellaire vetkussen-afgeleide MSC's, synoviale membraan-afgeleide MSC's, synoviale vloeistof-afgeleide MSC's, ligament fibroblasten, gewrichts chondrocyten, enz. 4,5,6. Deze cellen hebben het potentieel om op grote schaal te worden onderzocht in musculoskeletale weefseltechnologie-gebaseerd onderzoek. Daarom zou het kniegewricht een mogelijke en betrouwbare bron kunnen zijn van meerdere soorten MSC's. Vetdepot in het kniegewricht, bekend als de infrapatellar fat pad (IFP) of Hoffa's fat pad, is een veelbelovende en alternatieve keuze van MSC depot. De IFP is een relatief gemakkelijk toegankelijke en klinisch haalbare bron van MSC's, omdat het routinematig wordt gereseceerd en weggegooid als chirurgisch afval tijdens knieartroscopie of open kniechirurgie. Verwijdering van de IFP wordt geassocieerd met minimale morbiditeit op de donorplaats, waardoor het ook een aantrekkelijke weefselbron is. Hoewel ze een vergelijkbaar fenotypisch profiel hebben, hebben MSC's van IFP (IFP-MSC's) een verbeterd clonogene potentieel in vergelijking met van beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (BM-MSC's)6 en een betere proliferatieve capaciteit in vergelijking met subcutane adipose-afgeleide stamcellen (ADSC's)7. Interessant is dat in vergelijking met synoviale vloeistof-afgeleide MSC's (SF-MSC's), IFP-MSC's hun proliferatieve capaciteit niet verliezen bij late passages, noch neemt de verdubbelingstijd toe bij late passages. Dit suggereert dat IFP-MSC's tijdens celexpansie een voldoende groot aantal cellen kunnen bereiken voor in vitro weefselmanipulatietoepassingen zonder hun proliferatiesnelheid in gevaar te brengen8. Recente studies hebben ook gesuggereerd dat IFP-MSC's een superieur chondrogene differentiatiepotentieel bezitten in vergelijking met van beenmerg afgeleide MSC's (BMSCs) en van vetweefsel afgeleide MSC's (ADSC's), waarschijnlijk vanwege hun anatomische nabijheid tot gewrichtskraakbeen, wat wijst op hun geschiktheid voor kraakbeenweefseltechnologie 6,7,9,10. Bovendien bezitten ze ook leeftijdsonafhankelijk osteogene differentiatiepotentiaal11. Intra-articulaire injectie van IFP-MSC's heeft aangetoond dat het pijn vermindert en de functies van het kniegewricht verbetert bij patiënten met artrose (OA)12,13. Verder zijn sterke immunosuppressieve reacties en verbeterde immunomodulerende eigenschappen van IFP-MSC's in aanwezigheid van inflammatoire cytokines tijdens pathologische aandoeningen ook gemeld6.
IFP-MSC's zijn een veelbelovende en alternatieve bron van MSC's; hun therapeutische voordeel in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde wordt echter relatief minder onderzocht. De bestaande studies over IFP-MSC's hebben voornamelijk gebruik gemaakt van cellen van menselijke donoren. Onder deze, een paar recente studies hebben IFP-MSC's van gezonde menselijke donoren (niet-artritis patiënten, leeftijd 17-60 jaar)6,14 onderzocht, terwijl de meeste studies IFP-MSC's hebben gebruikt van oudere patiënten die een totale knievervangende operatie ondergaan (zieke patiënten, leeftijd 70-80 jaar). Aangezien bekend is dat zowel leeftijd als ziekte de normale werking van stamcellen veranderen (verminderd aantal en verlies van functioneel potentieel), kan dit mogelijk leiden tot inconsistenties in de uitkomst van de op MSC gebaseerde studies 7,15,16,17. Daarnaast vormt het gebruik van IFP-MSC's van patiënten met pathofysiologische aandoeningen (bijv. artritis en obesitas) ook problemen om de basiskenmerken van gezonde cellen in vitro te begrijpen, waardoor het een beperkende factor is bij de ontwikkeling van op MSC's gebaseerde therapieën. Om deze problemen op te lossen, is het gebruik van IFP-MSC's van gezonde donoren van vitaal belang. Omdat de toegang tot een gezonde menselijke donor een uitdaging is, kunnen diermodellen een beter alternatief zijn. In dit opzicht zijn er een paar studies waarbij IFP is geïsoleerd uit muizen18. Vanwege de kleine omvang van het vetkussen bij normale muizen, zijn vetweefsels van meerdere dieren echter gecombineerd om voldoende weefsel te krijgen om uitgebreide experimentele procedures uit te voeren19. Daarom is er behoefte aan een groot diermodel, dat zou kunnen voldoen aan de eis voor het hogere aantal cellen en tegelijkertijd zou kunnen voldoen aan de 3R-principes (verfijnen, vervangen en verminderen) in dieronderzoek20. Het gebruik van grote dieren heeft belangrijke implicaties in translationeel onderzoek. Specifiek, in musculoskeletale weefseltechnologie, is een reeks grote dieren zoals honden, varkens, schapen, geiten en paarden onderzocht21. Geit (Capra aegagrus hircus) is een uitstekende keuze van grote dieren omdat het verstikkingsgewricht de dichtstbijzijnde anatomie heeft bij het menselijke kniegewricht 22,23,24. De subchondrale bottrabeculaire structuur en subchondrale botdikte van geiten zijn vergelijkbaar met mensen, en het aandeel van het kraakbeen tot bot is ook gemeld dat het dicht bij de mensligt 21. Bovendien zijn geiten over de hele wereld op grote schaal gedomesticeerd, waardoor ze gemakkelijk beschikbaar zijn als ze skeletachtig volwassen zijn. Verder hebben lage onderhoudskosten en eenvoudige bediening ze tot een aantrekkelijk diermodel voor onderzoek gemaakt22.
In deze studie wordt een eenvoudig protocol voor de isolatie van IFP-MSC's uit het verstikkingsgewricht van Capra aegagrus hircus (geit) en in vitro kweekomstandigheden voor hun expansie en differentiatie aangetoond. De geïsoleerde cellen zijn adherent, hebben MSC-achtige morfologie, vormen CFU-F (kolonievormende eenheid-fibroblast) kolonies en bezitten adipogene, chondrogene en osteogene differentiatiepotentialen. Daarom tonen IFP-MSC's potentieel als een alternatieve bron van MSC's voor biomedische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol is gebaseerd op de isolatie van IFP-MSC's van geiten. Geiten-IFP en bloed werden verzameld in een lokaal slachthuis. Aangezien dergelijke weefselcollecties buiten het bereik van een institutionele commissie voor dierethiek vallen, was ethische goedkeuring niet vereist.
1. Isolatie van IFP-MSC's uit het femorotibiale gewricht van geitenknie
- Verzamel het femorotibiale gewricht (monster) van de geit dat ~ 15 cm elk van de femur- en tibiale gebieden van de achterpoten omvat. Plaats het monster onmiddellijk in een gesteriliseerde monsterverzamelingsdoos en bewaar het bij 4 °C voor transport naar het laboratorium voor verdere verwerking. Verwerk de monsters aseptisch in een bioveiligheidskast, met behulp van gesteriliseerde chirurgische hulpmiddelen gedurende de hele procedure (figuur 1, stap 1).
- Plaats het monster op een petrischaaltje van 150 mm en spoel het grondig af met geautoclaveerde fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met antibiotica (5 μg/ml amfotericine B, 200 U/ml penicilline-streptomycine en 50 μg/ml ciprofloxacine) om besmetting te voorkomen. Zorg er altijd voor dat het monster gehydrateerd wordt gehouden met PBS.
- Onderzoek zorgvuldig de anatomische gebieden van het monster. Voor gemakkelijke toegang tot het gewrichtskapsel, moet u ervoor zorgen dat de extra weefsels van beide lange botten volledig worden verwijderd (figuur 1, stap 2).
- Om dit te bereiken, houdt u eerst het eindoppervlak van het dijbeen met één hand vast en snijdt u met een scherpe schaar in de lengterichting naar het gewricht. Verwijder de omliggende spieren en vetweefsel uit het bot tijdens het proces. Zorg ervoor dat het weefsel rond het directe gewrichtskapsel in eerste instantie ongestoord blijft.
- Maak op dezelfde manier nog een incisie aan het tibiale uiteinde van het monster en verwijder de spieren en het vetweefsel uit het tibiale bot. Zorg ervoor dat zowel de lange botten volledig bloot liggen als het gewrichtskapsel duidelijk zichtbaar is na deze stap (figuur 1, stap 3).
- Maak vervolgens een incisie aan weerszijden van het synoviummembraan om het scharnierende gewricht open te snijden (figuur 1, stap 4). Knip de patella los van zowel het synoviummembraan als de patellabanden met behulp van een verse partij gesteriliseerde scharen en tangen. Bewaar de gescheiden patella onmiddellijk in een petrischaal met PBS (figuur 1, stap 5).
- Verwijder het volledige vetkussen dat aanwezig is op het binnenoppervlak van de patella met een schaar en een tang en verzamel het vetkussen in een andere verse petrischaal (figuur 1, stap 6). Gehakt het verzamelde vetkussen met behulp van een scalpel. Neem andere chirurgische hulpmiddelen op (bijv. Scharen of chirurgische messen) zoals vereist om de kleinst mogelijke vetstukjes / segmenten van ~ 2-3 mm te verkrijgen.
OPMERKING: Goed hakken is van cruciaal belang om te resulteren in een goede opbrengst van cellen. Houd het weefsel altijd gehydrateerd en laat het in geen enkel stadium van de isolatieprocedure drogen. - Breng het gehakte weefsel met behulp van een spatel over naar een centrifugebuis van 50 ml en was het met PBS aangevuld met antibiotica bij kamertemperatuur (RT) gedurende 15 minuten in een reageerbuismenger. Herhaal de wasstap 3x, elk 15 min.
- Voor enzymatische spijsvertering incubeer je het gehakte weefsel (~ 5 g) in Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM lage glucose) met 1,5 mg / ml type II collagenase (20 ml) en aangevuld met 2% FBS bij 37 ° C gedurende 12-16 uur.
OPMERKING: Voer de spijsvertering uit in een reageerbuismenger met ~ 15 rotaties per minuut (RPM). - Zuig het verteerde weefsel zorgvuldig op en filter het door een celzeef (70 μm) om onverteerde weefsels te verwijderen. Centrifugeer het filtraat in een centrifugebuis van 15 ml bij 150 x g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en was de pellet minstens 2x met DMEM lage glucose.
OPMERKING: Giet het verteerde weefsel langzaam in de zeef om morsen te voorkomen. Gebruik een centrifugebuis met een laag volume (15 ml) om een goede pellet te krijgen. - Resuspendatie van de verkregen celpellet in volledige DMEM-media (DMEM lage glucose aangevuld met 10% FBS en antibiotica [2,5 μg/ml amfotericine, 100 U/ml penicilline-streptomycine en 25 μg/ml ciprofloxacine]), in de volgende stappen uitbreidingsmedia genoemd in het protocol.
- Zaai de cellen op petrischalen van 150 mm en kweek ze in de expansiemedia aangevuld met 5 ng /ml basis fibroblastgroeifactor (bFGF) en 50 μg / ml 2-fosfo-L-ascorbinezuur trinatriumzout. Incubeer de cellen bij 37 °C in een 5% CO2-incubator om de cellen te laten hechten en vermenigvuldigen. Controleer dagelijks de aanhechting en groei van de cellen.
2. Onderhoud en uitbreiding van geïsoleerde cellen
- Verander de media om de 3 dagen totdat de cellen confluent worden. Voeg verse 5 ng/ml bFGF en 50 μg/ml 2-fosfo-L-ascorbinezuur trinatriumzout rechtstreeks toe aan de petrischaal telkens wanneer de media worden vervangen. Nadat de cellen 80% -90% confluent zijn geworden, subcultureer je de cellen.
OPMERKING: Verwijder de niet-adherente entiteiten tijdens elke mediawijziging. In het geval dat oliedruppels worden gezien na 3 dagen incubatie, was de cellen met PBS 1x en voeg vervolgens verse media toe aan de petrischaal. Ga door met PBS wassen voordat elke mediawissel plaatsvindt totdat de oliedruppels volledig zijn verwijderd. - Sub-kweken van cellen: Verwijder de expansiemedia uit de petrischaal en was de cellen 1x met PBS. Voeg 4 ml 0,25% trypsine/EDTA toe aan het gerecht en incubeer de cellen bij 37 °C in een 5% CO2-incubator gedurende 4 minuten.
OPMERKING: Confluency (80% -90%) wordt binnen 7 dagen bereikt. Verdeel de trypsine/EDTA-oplossing gelijkmatig over het gehele oppervlak van de petrischaal tijdens trypsinisatie. - Maak de cellen los door op de plaat aan de zijkant te tikken en onder een microscoop te observeren om te bevestigen dat alle cellen zijn losgemaakt. Neutraliseer de trypsine na toevoeging van een gelijk volume (4 ml) expansiemedia.
- Verzamel de gedissocieerde cellen met behulp van een pipet in een verse polypropyleenbuis van 15 ml en centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in het gewenste volume expansiemedia.
- Tel de cellen met behulp van de standaard celtelmethode en subcultuur in petrischalen van 150 mm met een zaaidichtheid van 1 x 104 cellen /cm2 voor verdere uitbreiding. Gebruik voor alle testen een confluente monolaag van cellen met passagenummer P2-P5.
OPMERKING: Cryopreserveer de overtollige cellen.
3. Evaluatie van het clonogene vermogen van IFP-MSC's met behulp van kolonievormende assay (CFU-F)
- Voor CFU-F-assay, zaai de cellen in expansiemedia in een 6-well weefselkweekplaat met een zaaidichtheid van 50-100 cellen / cm2. Voeg media toe om een eindvolume van 3 ml te verkrijgen.
OPMERKING: Optimaliseer de celconcentratie voor assays en behandeling. - Kweek de cellen gedurende 12 dagen bij 37 °C in een 5% CO2-incubator onder standaard kweekomstandigheden om de cellen kolonies te laten vormen. Verander de media elke 3 dagen. Wees zachtaardig tijdens het veranderen van de media.
- Spoel na 12 dagen de kolonies 1x met PBS en fixeer ze met 20% methanol gedurende 20 minuten op RT. Kleur de kolonies met kristalvioletkleurstof (0,5% [w / v] in 20% methanol) gedurende 20 minuten bij RT. Tel de afzonderlijke kolonies met behulp van een omgekeerde microscoop.
OPMERKING: Een kolonie wordt gedefinieerd als een cluster van meer dan 50 cellen.
4. Differentiatiepotentieel van IFP-MSC's
- Induceren van adipogene differentiatie van IFP-MSC's
- Om adipogenese te induceren, zaait u de cellen met een dichtheid van 25 x 103 cellen / cm2 in een weefselkweekplaat met 24 putten. Voeg media toe om een eindvolume van 500 μL te verkrijgen. Kweek de cellen bij 37 °C in een 5% CO2-incubator .
- Vervang op een dag na de confluentie het expansiemedium door 500 μL adipogene differentiatiemedia. Het duurt ongeveer 2 dagen voordat de cellen confluency bereiken.
- Bereid de adipogene differentiatiemedia voor door expansiemedia (DMEM + 10% FBS + 2,5 μg / ml amfotericine, 100 U / ml penicilline-streptomycine en 25 μg / ml ciprofloxacine) aan te vullen met 25 mM D (+) -glucose, 10 μg / ml insuline, 1 μM dexamethason en 100 μM indomethacine.
OPMERKING: Differentiatiemedia zijn onstabiel bij 4 °C na 1 maand; bereid daarom de media voor wanneer en wanneer dat nodig is. - Beschouw de cellen gekweekt in de expansiemedia aangevuld met 25 mM D (+) glucose als niet-geïnduceerde controles. Verander de media elke 3 dagen gedurende 14 dagen. Was aan het einde van de 14 dagen de cellen 1x met PBS. Fixeer de cellen met neutraal gebufferd formaline (NBF; 4 % formaldehyde in PBS) gedurende 15 minuten bij 4 °C.
- Was na fixatie de putjes 1x met gedestilleerd water en incubeer de cellen vervolgens met 60% isopropanol gedurende 5 minuten op RT. Na het verwijderen van isopropanol, kleur de lipidedruppels door de cellen te incuberen met 500 μL van de werkoplossing van Oil Red O kleurstof gedurende 5 minuten bij RT. Was de putjes 1x met gedestilleerd water om de ongebonden kleurstof te verwijderen en beeld de cellen af met behulp van een omgekeerde microscoop.
OPMERKING: Bereid de stamoplossing van Oil Red O (ORO) door 300 mg ORO op te lossen in 100 ml 99% isopropanol. Om de werkoplossing te bereiden, mengt u drie delen voorraad ORO en twee delen gedestilleerd water en laat u het gedurende 10 minuten op RT mengen. Filtreer het mengsel met 0,2 μm filtreerpapier. De werkoplossing is klaar voor gebruik. De stamoplossing kan 1 maand in het donker bij RT worden bereid en bewaard, terwijl de werkoplossing vóór elk gebruik /kleuring vers moet worden bereid.
- Chondrogene differentiatie van IFP MSC's induceren
- Isolatie van geitenplasma:
- Bereid 3,4% (g/v) natriumcitraat in gedestilleerd water. Voeg 5 ml van de bereide natriumcitraatoplossing toe aan een centrifugebuis van 50 ml.
- Verzamel 45 ml vers geïsoleerd geitenbloed in dezelfde buis. Kantel de buis onmiddellijk om het bloed grondig met natriumcitraat te mengen om stolling te voorkomen en transporteer het naar het laboratorium bij 4 °C.
- Centrifugeer het verzamelde geitenbloed bij 1000 x g gedurende 20 min bij 4 °C. Breng het supernatant (plasma) over in een verse buis in een bioveiligheidskast. Filtreer het plasma door 0,2 μm filters, aliquot, en bewaar bij -20 °C voor verder gebruik.
OPMERKING: Houd de temperatuur van 2-8 °C aan tijdens het hanteren van de monsters. Het is belangrijk om de vries-dooicycli van plasma te minimaliseren.
- Kweek de geëxpandeerde cellen tot 80% -90% confluency, dissocieer de cellen met behulp van trypsine / EDTA-oplossing en pelleteer de cellen op 150 x g gedurende 5 minuten in een centrifugebuis van 15 ml. Resuspensie de pellet in geitenplasma met een dichtheid van 2 x 106 cellen per 50 μL plasmaoplossing.
- Voeg een druppel plasmabevattende cellen (50 μL) toe aan een gesteriliseerde petrischaal van 90 mm en voeg vervolgens calciumchloride toe in een eindconcentratie van 0,3% (g/v). Meng goed om cross-linked plasma hydrogel te fabriceren.
- Incubeer de gefabriceerde hydrogel bij 37 °C gedurende 40 min. Breng na incubatie de hydrogels over naar 24-well weefselkweekplaten met chondrogene media.
- Bereid chondrogene media door DMEM lage glucose aan te vullen met 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonzuur (HEPES), 1,25 mg/ml runderserumalbumine (BSA), 1 mM proline, 50 μg/ml 2-fosfo-L-ascorbinezuur trinatriumzout, 100 nM dexamethason, 1x insuline, transferrine, natriumseleniet + linolzuur-BSA (ITS+1), antibiotica (2,5 μg/ml amhotericine, 100 U/ml penicilline-streptomycine en 25 μg/ml ciprofloxacine), en 10 ng/ml transformerende groeifactor- β1 (TGF-β1).
- De hydrogels gekweekt in volledige DMEM-media (DMEM lage glucose met 10% FBS en antibiotica [2,5 μg/ml amfotericine, 100 U/ml penicilline-streptomycine en 25 μg/ml ciprofloxacine]) zonder TGF-β1 worden beschouwd als niet-geïnduceerde controles. Verander de media elke 3 dagen gedurende 14 dagen.
- Na 14 dagen chondrogene differentiatie van cellen in plasmahydrogels, wast u de hydrogels met PBS 3x gedurende 5 minuten elk en fixeert u de monsters vervolgens gedurende 3 uur in NBF.
LET OP: Formaldehyde is een potentieel carcinogeen en kan irritatie van de neus, keel en longen veroorzaken bij inademing. Voer alle procedures met betrekking tot formaldehyde uit in een zuurkast. - Verwijder NBF, was de hydrogels met PBS 3x gedurende 5 minuten elk en incubeer vervolgens in 35% (w / v) sucrose op RT een nacht om de oplossing volledig in de monsters te laten opnemen. Acclimatiseer de hydrogels in optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding gedurende 3 uur. Integreer de monsters in OCT-verbinding met behulp van siliconenmalen onder vloeibare stikstof.
- Snijd de monsters op een dikte van 10-12 μm op met gelatine beklede glasglaasjes met behulp van een cryotoom en bewaar ze bij -20 °C voor toekomstig gebruik. Om de aanwezigheid of afzetting van de extracellulaire matrix na chondrogene differentiatie te onderzoeken, kleurt u de secties met Alcian Blue en Safranin-O-kleurstof, die binden aan gesulfateerde glycosaminoglycanen.
OPMERKING: Om Alcian Blue kleurstof te bereiden, lost u 1 g Alcian Blue-kleurstof op in 100 ml 0,1 N HCl en mengt u grondig in een reageerbuismenger een nacht. De oplossing kan 1 maand in het donker bij RT worden bewaard. Om Safranin-O-kleurstof te bereiden, lost u 0,1 g Safranin-O-kleurstof op in 100 ml gedestilleerd water en mengt u grondig in een reageerbuismenger een nacht. - Voor Alcian Blue kleuring, was de hydrogel secties 1x met gedestilleerd water gedurende 5 min. Om de secties te repareren, voegt u 4% NBF toe aan de dia's en incubeert u gedurende 30 minuten.
- Was de secties 1x met gedestilleerd water gedurende 5 min en vervolgens 2x met 0,1 N HCl gedurende 30 s elk. Verwijder de HCl en droog de dia's voorzichtig af met tissuepapier. Voeg de bereide Alcian Blue-vlek toe aan de secties en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in een bevochtigde kamer.
- Was de ongebonden kleurstof met 0,1 N HCl en destilleer vervolgens 3 min. Droog de secties uit in absolute ethanol, verwijder ze in xyleen en monteer ten slotte de gekleurde secties in een harsachtig medium voor beeldvorming.
- Voor Safranin-O-kleuring wast u de hydrogelsecties 1x gedurende 5 minuten met gedestilleerd water. Om de secties te repareren, voegt u 4% NBF toe aan de dia's en incubeert u gedurende 30 minuten. Was de secties 1x met gedestilleerd water gedurende 5 minuten en dompel de dia's vervolgens 10-15 s in 1% azijnzuur. Droog de dia's voorzichtig af met tissuepapier.
- Voeg bereide Safranin-O kleurstof toe aan de secties en incubeer gedurende 10 minuten bij RT. Was de ongebonden kleurstof met 100% ethanol. Dompel de dia's gedurende 5 minuten in 100% ethanol. Droog de dia's aan de lucht, maak ze vrij in xyleen en monteer ten slotte de gekleurde secties in een harsachtig medium voor beeldvorming.
- Isolatie van geitenplasma:
- Induceren van osteogene differentiatie van IFP MSC's
- Om osteogene differentiatie te induceren, trypsiniseert u de cellen, zoals eerder vermeld (stap 2.2.). Zaai de cellen met een dichtheid van 3 x 103 cellen/cm2 in een 24-well weefselkweekplaat. Voeg media toe om een eindvolume van 500 μL te verkrijgen. Kweek de cellen bij 37 °C in een 5% CO2-incubator . Vervang 1 dag na het zaaien de expansiemedia door 500 μL osteogene differentiatiemedia.
- Bereid de osteogene media voor door expansiemedia (DMEM + 10% FBS +2,5 μg/ml amfotericine, 100 U/ml penicilline-streptomycine en 25 μg/ml ciprofloxacine) aan te vullen met 25 mM D (+)-glucose, 10 nM dexamethason, 10 mM β-glycerofosfaat, 50 μg/ml 2-fosfo-L-ascorbinezuur trinatriumzout en 10 nM vitamine D3.
OPMERKING: De cellen gekweekt in expansiemedia aangevuld met 25 mM D (+) glucose worden beschouwd als niet-geïnduceerde controles. - Verander de osteogene media elke 3 dagen gedurende 14 dagen of 28 dagen. Meet aan het einde van 14 dagen de mate van osteogenese door alkalische fosfatase (ALP) kleuring.
OPMERKING: Om het substraat voor te bereiden op ALP-kleuring, lost u één 5-broom-4- chloor-3-indolylfosfaat (BCIP) / nitroblauw tetrazolium (NBT) tablet op in 10 ml gedestilleerd water in een centrifugebuis van 15 ml. Laat de tablet volledig oplossen. De substraatoplossing is klaar voor gebruik. Omdat de substraatoplossing niet langer kan worden bewaard, op basis van behoefte, breekt u de tablet doormidden en lost u deze op in 5 ml gedestilleerd water. Om de permeabilisatiebuffer voor te bereiden, voegt u trisbuffer (100 mM) en magnesiumchloride (5 mM) toe aan gedestilleerd water. Voeg Triton X100 (0,1%) toe aan de oplossing en laat deze oplossen. Stel de pH van de oplossing in op 9,25-9,75. - Voor ALP-kleuring, na 14 dagen inductie, verwijder de media en was de cellen met PBS. Fixeer de cellen met NBF (4%) gedurende 1 minuut. Was de cellen met PBS en permeate met behulp van de voorbereide lysisbuffer gedurende 2-3 minuten.
- Voeg 500 μL van de bereide substraatoplossing toe aan de cellen en laat deze gedurende 15 minuten tot 1 uur incuberen, afhankelijk van het expressieniveau. Controleer de ontwikkeling van paars/blauwe kleur tussendoor.
- Verwijder de substraatoplossing en was met gedestilleerd water. Beeld de gekleurde cellen af met een omgekeerde microscoop.
- Meet aan het einde van 28 dagen de mate van verkalking na osteogene inductie door Alizarin Red-S-kleuring.
OPMERKING: Om de Alizarin Red-S kleuringsoplossing (40 mM) te bereiden, lost u 2 g Alizarin Red-S op in 100 ml gedestilleerd water en past u de pH aan op 4,1-4,3 met HCl of NH4OH. Filtreer de oplossing door een membraan van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C in het donker. De pH van de oplossing is belangrijk; daarom wordt aanbevolen om een nieuwe oplossing te maken of om de pH van de oplossing opnieuw te meten als deze meer dan 1 maand oud is. - Voor Alizarin Red-S-kleuring, na 28 dagen inductie, verwijder de media en was de cellen 1x met koude PBS. Bevestig de cellen met 70% ethanol gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Verwijder het fixeermiddel en was de cellen 2x met gedestilleerd water. Verwijder het water volledig en voeg 1 ml Alizarin Red-S-oplossing toe aan elke put.
- Incubeer de cellen met de oplossing gedurende 1 uur bij RT en breng de cellen in beeld met behulp van een omgekeerde microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolatie van IFP-MSC's uit het femorotibiale gewricht van de geit
De stappen die betrokken zijn bij de isolatie van IFP-MSC's van het verstikkingsgewricht van een geit zijn weergegeven in figuur 1. Het vetkussen dat aanwezig was in het binnenste niet-articulerende oppervlak van de patella werd verwijderd, gehakt en enzymatisch verteerd. De IFP-MSC's werden met succes geïsoleerd en in vitro gekweekt (figuur 2A).
Uitbreiding en clonogene capaciteit van IFP-MSC's
De geïsoleerde cellen werden in vitro gekweekt in expansiemedia. De cellen begonnen zich binnen 12 uur na het zaaien aan de weefselkweekplaat te hechten en waren meestal rond van vorm op dag 0. Ze waren homogeen aan de plaat gehecht en bereikten binnen 24 uur een langwerpige morfologie. Deze morfologie werd gehandhaafd gedurende de hele duur van de cultuur. De cellen prolifereerden efficiënt in cultuur en werden 80% -90% confluent binnen 6 dagen na expansie (figuur 2A). Bovendien vertoonden de geïsoleerde cellen clonogene capaciteit, beoordeeld door kolonievormende eenheid-fibroblast (CFU-F) assay (figuur 2B). Deze resultaten geven aan dat de geïsoleerde cellen in vitro efficiënte proliferatieve en zelfvernieuwende mogelijkheden hebben.
Differentiatiepotentieel van IFP-MSC's
Om te karakteriseren of de geïsoleerde cellen multipotent waren en karakteristieke kenmerken van MSC's bezaten, werden ze geïnduceerd om te differentiëren in meerdere afstammingslijnen. De geïsoleerde cellen produceerden, wanneer ze werden geïnduceerd tot adipogene afstamming, lipidedruppeltjes, zoals kan worden waargenomen op de brightfield-beelden (figuur 3A). Dit werd verder bevestigd door Oil Red O-kleuring op dag 14 en dag 21, wat suggereert dat deze cellen kunnen differentiëren tot adipocyten. Aan de andere kant werden geen zichtbare oliedruppels waargenomen in de cellen gekweekt in afwezigheid van adipogene-inducerende factoren (figuur 3B,C).
Om het chondrogene potentieel van de geïsoleerde cellen te bepalen, werden de cellen ingekapseld in plasmahydrogel en mochten ze differentiëren in de chondrogene afstamming. Zoals weergegeven op basis van de grove beelden van de plasmahydrogel (figuur 4A), leek de neotissue gevormd na 14 dagen in de geïnduceerde groep wit en glanzend (vergelijkbaar met gewrichtskraakbeen), terwijl het in de niet-geïnduceerde groep bleekwit was en verminderde glans werd waargenomen. Bovendien waren de cellen in de geïnduceerde groep in staat om een van de belangrijkste componenten van de kraakbeenmatrix (d.w.z. gesulfateerde glycosaminoglycanen) af te scheiden, wat blijkt uit positieve histologische kleuring voor Alcian Blue (figuur 4B) en Safranin O (figuur 4C). Daarentegen waren de hydrogelsecties van de niet-geïnduceerde groepen negatief voor Safranin O- en Alcian Blue-kleuring. Deze resultaten geven gezamenlijk het chondrogene differentiatiepotentieel van de MSC's aan in de aanwezigheid van chondrogene stimuli.
De geïsoleerde cellen vertoonden ook osteogene differentiatiepotentiaal. Na 14 dagen en 21 dagen in cultuur werd geen spontane mineralisatie waargenomen (niet-geïnduceerde groep). Echter, wanneer geïnduceerd met osteogene media, was mineralisatie duidelijk door de positieve kleuring voor alkalische fosfatase (ALP) aan het einde van 14 dagen (figuur 5A). Bovendien werden na 28 dagen kweek in osteogene media verkalkte afzettingen gevisualiseerd door positieve Alizarin Red-S-kleuring (figuur 5B). Deze resultaten tonen aan dat de geïsoleerde cellen van geiten infrapatellar fat pad, wanneer geïnduceerd, het potentieel hebben om te differentiëren in adipogene, chondrogene en osteogene afstammingslijnen.
Figuur 1: Schematisch voor de isolatie van IFP-MSC van het verstikkingsgewricht van geitenknie. Stap 1. Verzamel het geitenkniemonster uit het slachthuis en ga verder met de dissectie in een bioveiligheidskast; Stap 2. Onderzoek zorgvuldig de anatomie van het weefsel en verwijder de omliggende spieren en vetweefsel; Stap 3. Zonder het gewrichtskapsel te verstoren, verwijdert u de spieren en vetweefsels om zowel de lange botten (dijbeen en scheenbeen) volledig bloot te leggen; Stap 4. Maak een incisie in het synoviummembraan en snijd het knikgewricht open om de patella en trochleair kraakbeen bloot te leggen; Stap 5. Verwijder de patella voorzichtig uit het scharnierende gewricht, zonder de infrapatellar fat pad (IFP) te verstoren, en bewaar het op een petrischaal met PBS; Stap 6. Verwijder langzaam het hele vetkussen van de patella en bewaar het in een verse petrischaal voor fijngehakt en enzymatische spijsvertering. (a. Dijbeen, b. Tibia, c. Patella, d. Trochleair kraakbeen, e. Infrapatellar fat pad). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfologie en clonogene potentiaal van IFP-MSC's. (A) Microfoto's werden genomen bij passage 3 met behulp van een omgekeerde brightfieldmicroscoop bij 10x vergroting. Onmiddellijk na het zaaien (dag 0) bleven de cellen rond van vorm, op dag 3 bereikten de meeste cellen een langwerpige morfologie en op dag 6 werden de IFP-MSC's 80% -90% confluent (schaalbalk = 100 μm). (B) Representatieve foto's (n = 3) van CFU-F kolonies gekleurd met kristalvioletkleurstof na 12 dagen zaaien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Adipogene differentiatie van IFP-MSC's. Het bovenste paneel geeft micrografieën aan van niet-geïnduceerde IFP-MSC's en het onderste paneel vertegenwoordigt IFP-MSC's geïnduceerd in de adipogene afstamming. (A) Representatieve brightfieldbeelden die de vorming van lipide vacuolen tijdens adipogenese laten zien (Scale bar = 100 μm). Representatieve beelden van olierode O-kleuring van lipidedruppels op (B) dag 14 en (C) dag 21 van differentiatie (schaalbalk = 20 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Chondrogene differentiatie van IFP-MSC's. Het bovenste paneel geeft hydrogelconstructies / secties aan van niet-geïnduceerde hydrogel en het onderste paneel vertegenwoordigt hydrogel onderworpen aan chondrogenese. (A) Brutobeelden van plasmahydrogelconstructen na 14 dagen in cultuur in afwezigheid (niet-geïnduceerd) of aanwezigheid (geïnduceerd) van chondrogene media aangevuld met TGF-β1. Representatieve beelden van 10 μm secties hydrogel gekleurd met sGAG bindende kleurstof (B) Alcian Blue (blauw) en (C) Safranin O (rood) (Schaalbalk = 100 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Osteogene differentiatie van IFP-MSC's. Het bovenste paneel geeft niet-geïnduceerde cellen aan en het onderste paneel geeft cellen aan die zijn geïnduceerd met osteogene media. Micrografieën en representatieve beelden van IFP-MSC's gekleurd met (A) BCIP-NBT (alkalische fosfatase) na 14 dagen en (B) Alizarine Red-S (calciumdepositie) na 28 dagen differentiatie (Schaal staaf = 100 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol is een eenvoudige, betrouwbare en reproduceerbare methode voor de isolatie van MSC's van geiten-IFP opgenomen. Cellen geïsoleerd met behulp van deze methode zijn met succes gebruikt in onze eerdere studies voor in vitro weefselregeneratie. Er werd waargenomen dat de geïsoleerde cellen proliferatief waren, reageerden op verschillende groeifactoren en hun biologische activiteit behielden wanneer ze werden gezaaid op elektrospunvezels en steigers25,26. Bovendien werd waargenomen dat een groot aantal hoogwaardige MSC's kan worden verkregen en gecoconcultureerd met chondrocyten in injecteerbare hydrogels om gewrichtskraakbeen in vitro te engineeren 27,28,29. Hoewel de procedure voor de dissectie en isolatie van cellen eenvoudig is, zijn er een paar stappen die zorgvuldig moeten worden gevolgd voor de succesvolle isolatie en uitbreiding van MSC's van IFP. Ten eerste, omdat het niet mogelijk is om echt aseptische omstandigheden te behouden tijdens het brengen van het monster uit het slachthuis, wordt geadviseerd om het buitenste weefsel af te vegen met 70% ethanol om het weefsel te steriliseren voordat de isolatieprocedure wordt gestart. De volgende belangrijke stap is het ontleden van het vetkussen van het kniegewricht. De IFP bevindt zich onder de patella in het kniegewricht. Het proximale uiteinde van de IFP is bevestigd aan het distale uiteinde van de patella30,31. Daarom wordt het erg belangrijk om de juiste locatie van de patella te identificeren tijdens het uitvoeren van de isolatieprocedure. Aangezien IFP vervolgens articuleert met het trochleaire kraakbeen in het dijbeen en bedekt is met het synoviummembraan30,31, is het maken van een incisie naar het synoviummembraan noodzakelijk om het kniegewricht open te snijden. Het is ook cruciaal om de algehele gezondheid van het verzamelde infrapatellaire vetkussen te observeren. Omdat de IFP is samengesteld uit adipocyten (cellen) en vetbindenweefsel, zoals collageen en glycosaminoglycanen, wordt het weefsel gehakt en verteerd met behulp van collagenase-enzym om de cellen vrij te maken 9,32. De zwevende adipocyten worden gescheiden door centrifugatie met een lage snelheid om een homogene cultuur van MSC's te hebben. De resterende adipocyten in de stromale vasculaire fractie moeten bij elke mediawissel uit de weefselkweekplaat worden verwijderd door de celmonolaag met PBS te wassen voordat nieuwe media worden toegevoegd. Deze stap moet worden voortgezet totdat alle zichtbare adipocyten zijn verwijderd. Er wordt voorgesteld om de cellen opnieuw in een nieuwe plaat te plaatsen nadat P0-cellen samenvloeiing hebben bereikt om de resterende adipocyten kwijt te raken, die zich mogelijk aan de plaatwand hebben gehecht en moeilijk te verwijderen zijn. Ten slotte, aangezien de geitenmonsters meestal uit een slachthuis worden verkregen, is het moeilijk om de exacte leeftijd van de geit te traceren, en daarom moet, terwijl de cellen worden geïsoleerd, de variatie tussen monsters zorgvuldig worden geobserveerd en gedocumenteerd. Er wordt voorgesteld om de cellen te karakteriseren voor zelfvernieuwing (CFU-F), proliferatie en differentiatiepotentieel na elke isolatie voordat ze worden gebruikt voor verschillende toepassingen en mechanistische studies. Vanwege de behoefte aan een groot aantal cellen in op cellen gebaseerde weefseltechnologietoepassingen, worden de kweekomstandigheden die proliferatie vergemakkelijken, senescentie vertragen en de stamheid van cellen behouden, centraal belangrijk. Er werd waargenomen dat MSC's gekweekt in 2-fosfo-L-ascorbinezuur trinatriumzout (PAA) en basische fibroblastgroeifactor (bFGF) een ~ 42-voudige toename van hun aantal vertoonden in vergelijking met MSC's gekweekt in bFGF alleen. Bovendien verminderde de co-behandeling van PAA en bFGF de productie van reactieve zuurstofsoorten (vanwege hun antioxiderende eigenschappen) en senescentie in stamcellen. Daarom is het gebruik van PAA tijdens in vitro expansie van MSC's wenselijk33.
Hoewel enzymatische vertering van weefsels universeel wordt gebruikt en een efficiënte methode is voor het isoleren van MSC's, is het gebruik van enzymen zoals collagenasen tijdrovend en duur34. In deze studie duurde de volledige vertering van het weefsel met behulp van collagenase 12-16 uur ('s nachts), wat zou kunnen leiden tot een verminderde levensvatbaarheid of een veranderd oppervlaktefenotype van cellen35. Daarom kan de methode verder worden geoptimaliseerd om de duur van de collagenasebehandeling voor weefselvertering te verkorten. Als alternatief kan een enzymvrije explantcultuurmethode die wordt gebruikt voor de isolatie van van vetweefsel afgeleide MSC's uit lipoaspiraten of inguinale vetkussens ook worden onderzocht voor de isolatie van IFP-MSC's 34,36,37.
IFP-MSC's, vanwege hun vermogen om te differentiëren in chondrogene, adipogene en osteogene afstammingslijnen, bezitten een breed therapeutisch potentieel. Eerdere rapporten hebben aangetoond dat IFP-MSC's een beter chondrogene potentie vertonen dan andere stamcellen 6,7,9,10. Vandaar dat IFP-MSC's interesse hebben gekregen en worden beschouwd als een betere kandidaat voor celgebaseerde therapie voor het herstel van kraakbeendefecten en het verlichten van kraakbeenafbraak bij artrose. In een preklinische studie resulteerde co-toediening van IFP-MSC's met kraakbeen extracellulaire matrixcomponenten door intra-articulaire injectie in verbeterde kraakbeenregeneratie bij osteochondrale defecten38. Evenzo leidde intra-articulaire injectie van IFP-MSC's in het konijnenartrose (OA) -model tot een afname van de volgende ziekteparameters: kraakbeenafbraak, osteofytvorming, subchondrale botverdikking en synovitis39. Bovendien hebben de resultaten van een eerder gerapporteerde gerandomiseerde klinische studie13 en een onlangs gepubliceerde open fase 1 klinische studie40 aangetoond dat intra-articulaire injecties van IFP-MSC's bij patiënten met knieartrose veilig zijn en resulteren in de vermindering van pijn en verbetering van de gewrichtsfunctie, wat hun veelbelovende therapeutische potentieel aangeeft bij het verbeteren van knie-OA-gerelateerde complicaties. Van IFP-MSC's is ook aangetoond dat ze verhoogde immunomodulerende eigenschappen ontwikkelen in aanwezigheid van pro-inflammatoire signalen door de afbraak van een ontstekingsregulator, Stof P (SP), te vergemakkelijken, wat leidt tot een vermindering van pro-inflammatoire en katabole moleculen en, als gevolg daarvan, een verbeterde behandeling van ontsteking en fibrose van synovium en IFP6 . Wat nog belangrijker is, IFP-MSC's verwerkt in regulatoire omstandigheden vertoonden betere proliferatie, differentiatiecapaciteit en immunomodulerende eigenschappen in vergelijking met standaard in vitro kweekomstandigheden, wat hun potentieel voor klinisch succes aantoont bij gebruik voor mesenchymale stamcel (MSC) -gebaseerde therapie41.
Concluderend beschrijft dit protocol de isolatie van infrapatellaire vetkussen (IFP) -afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) van geitenstiksel door enzymatische spijsvertering en hun onderhoud in cultuur. De geïsoleerde cellen hebben proliferatief en zelfvernieuwingspotentieel en kunnen differentiëren in adipogene, osteogene en chondrogene afstammingslijnen. IFP-MSC's zijn een veelbelovende bron van MSC's en hebben translationeel potentieel voor toepassingen in regeneratieve geneeskunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.
Acknowledgments
SH erkent de steun van de Institute Post-Doctoral Fellowship van IIT Kanpur en SYST-subsidie van DST (SEED Division) (SP / YO / 618/ 2018). AM erkent het Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) voor een Instituut fellowship. DSK erkent Gireesh Jankinath Chair Professorship en Department of Biotechnology, India, voor financiering (BT / PR22445 / MED / 32/571/2016). AM, SH en DSK bedanken het Mehta Family Centre for Engineering in Medicine bij IIT-Kanpur voor hun genereuze steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422-10G | 10 mM |
| 0.25% Trypsin- 0.02% EDTA | Hi-Media | TCL049 | |
| 15-mL centrifuge tube | Corning | ||
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | 50 µg/mL |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | HiMedia | TCL021-50ml | 10 mM |
| 50-mL centrifuge tube | Corning | ||
| Alcian Blue | Hi-Media | RM471 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Alizarin Red S | S D Fine-Chem Limited | 26048-25G | For calcium deposition |
| Amphotericin B | HiMedia | A011 | 2.5 µg/mL |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Sino Biologicals | 10014-HNAE | 5 ng/mL |
| BCIP/NBT ALP Substrate | Sigma | B5655-5TAB | For ALP staining |
| Biological safety cabinet | |||
| BSA | HiMedia | MB-083 | Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL ) |
| Cell strainer | HiMedia | TCP-182 | 70 µm |
| Centrifuge | REMI | ||
| Ciprofloxacin | RANBAXY LAB. Limited | B17407T1 | 2.5 µg/mL |
| Crystal Violet | S D Fine-Chem Limited | 42555 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.94925.0521 | 25 mM |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 µM |
| DMEM LG | SIGMA | D5523 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FBS | Gibco | 10270 | Long name: Fetal Bovine Serum |
| Formaldehyde solution 37%-41% | Merck | 61780805001730 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 µM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | 10 µg/mL |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS 100 | ||
| ITS + 1 | Sigma-Aldrich | I2521-5mL | Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA |
| L-Proline | HiMedia | TO-109-25G | 1 mM |
| Magnesium chloride | Merck | 61751605001730 | For lysis buffer |
| Methanol | Meck | 1.07018.2521 | |
| Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Thermoscientific | ||
| MUSE Cell analyser | Merck Millipore | For cell counting | |
| OCT compound | Tissue-Tek | 4583 | Long name: Optimal Cutting Temperature |
| Oil Red O dye | S D Fine-Chem Limited | 54304 | For lipid vacuole staining |
| Penicillin-Streptomycin | HiMedia | A007 | 100 U/mL |
| Petri dishes (150 mm and 90 mm) | NEST | ||
| Safranin O | S D Fine-Chem Limited | 50240 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C3434 | 3.4 % (w/v) |
| Sterile scissors, forceps and scalpels | For isolation of IFP-MSC | ||
| Sucrose | Merck | 1.94953.0521 | 35 % (w/v) |
| TGF-β1 | Sino Biologicals | Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL) | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Thermoscientific | ||
| Tris buffer | Merck | 61771405001730 | For lysis buffer |
| Triton X100 | S D Fine-Chem Limited | 40632 | For lysis buffer |
| Type II collagenase | Gibco | 17101015 | 1.5 mg/mL |
| Vitamin D3 | Sigma | C9756-1G | 10 nM |
| Well plates (6 -WP and 24-WP) | NEST |
References
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regenerative Medicine. 4 (1), 22 (2019).
- Guo, Y., Yu, Y., Hu, S., Chen, Y., Shen, Z. The therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cardiovascular diseases. Cell Death & Disease. 11 (5), 349 (2020).
- Ge, Z., Goh, J. C. H., Lee, E. H. Selection of cell source for ligament tissue engineering. Cell Transplantation. 14 (8), 573-583 (2005).
- Harvanová, D., Tóthová, T., Sarissky, M., Amrichová, J., Rosocha, J. Isolation and characterization of synovial mesenchymal stem cells. Folia Biologica. 57 (3), 119-124 (2011).
- Kouroupis, D., et al. Infrapatellar fat pad-derived MSC response to inflammation and fibrosis induces an immunomodulatory phenotype involving CD10-mediated Substance P degradation. Scientific Reports. 9 (1), 10864 (2019).
- Lopa, S., et al. Donor-matched mesenchymal stem cells from knee infrapatellar and subcutaneous adipose tissue of osteoarthritic donors display differential chondrogenic and osteogenic commitment. European Cells & Materials. 27, 298-311 (2014).
- Garcia, J., et al. Characterisation of synovial fluid and infrapatellar fat pad derived mesenchymal stromal cells: The influence of tissue source and inflammatory stimulus. Scientific Reports. 6 (1), 24295 (2016).
- Tangchitphisut, P., et al. Infrapatellar fat pad: an alternative source of adipose-derived mesenchymal stem cells. Arthritis. 2016, 4019873 (2016).
- Ding, D. -C., et al. Human infrapatellar fat pad-derived stromal cells have more potent differentiation capacity than other mesenchymal cells and can be enhanced by hyaluronan. Cell Transplantation. 24 (7), 1221-1232 (2015).
- Khan, W., Adesida, A., Tew, S., Andrew, J., Hardingham, T. The epitope characterisation and the osteogenic differentiation potential of human fat pad-derived stem cells is maintained with ageing in later life. Injury. 40 (2), 150-157 (2009).
- Koh, Y. G., et al. Mesenchymal stem cell injections improve symptoms of knee osteoarthritis. Arthroscopy. 29 (4), 748-755 (2013).
- Koh, Y. G., Choi, Y. J. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis. Knee. 19 (6), 902-907 (2012).
- Kouroupis, D., Willman, M. A., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell-based spheroids enhance their therapeutic efficacy to reverse synovitis and fat pad fibrosis. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 44 (2021).
- Stocco, E., et al. Infrapatellar fat pad stem cells responsiveness to microenvironment in osteoarthritis: from morphology to function. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 323 (2019).
- Hindle, P., Khan, N., Biant, L., Péault, B. The infrapatellar fat pad as a source of perivascular stem cells with increased chondrogenic potential for regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 77-87 (2017).
- Stolzing, A., Jones, E., McGonagle, D., Scutt, A. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (3), 163-173 (2008).
- Wu, C. L., Diekman, B. O., Jain, D., Guilak, F. Diet-induced obesity alters the differentiation potential of stem cells isolated from bone marrow, adipose tissue and infrapatellar fat pad: the effects of free fatty acids. International Journal of Obesity (2005). 37 (8), 1079-1087 (2013).
- Barboza, E., et al. Profibrotic infrapatellar fat pad remodeling without M1 macrophage polarization precedes knee osteoarthritis in mice with diet-induced obesity. Arthritis & Rheumatology. 69 (6), 1221-1232 (2017).
- Allen, M. J., Hankenson, K. D., Goodrich, L., Boivin, G. P., von Rechenberg, B. Ethical use of animal models in musculoskeletal research. Journal of Orthopaedic Research. 35 (4), 740-751 (2017).
- Moran, C. J., et al. The benefits and limitations of animal models for translational research in cartilage repair. Journal of Experimental Orthopaedics. 3 (1), (2016).
- Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11 (1), 19 (2016).
- Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
- Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. The Knee. 19 (4), 493-499 (2012).
- Bhutada, S. S., Sriram, M., Katti, D. S. Sulfated carboxymethylcellulose conjugated electrospun fibers as a growth factor presenting system for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 268, 118256 (2021).
- Waghmare, N. A., Arora, A., Bhattacharjee, A., Katti, D. S. Sulfated polysaccharide mediated TGF-β1 presentation in pre-formed injectable scaffolds for cartilage tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 193, 62-72 (2018).
- Arora, A., Mahajan, A., Katti, D. S. TGF-β1 presenting enzymatically cross-linked injectable hydrogels for improved chondrogenesis. Colloids & Surfaces B: Biointerfaces. 159, 838-848 (2017).
- Arora, A., Sriram, M., Kothari, A., Katti, D. S. Co-culture of infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cells and articular chondrocytes in plasma clot for cartilage tissue engineering. Cytotherapy. 19 (7), 881-894 (2017).
- Mahajan, A., Singh, A., Datta, D., Katti, D. S. Bioinspired injectable hydrogels dynamically stiffen and contract to promote mechanosensing-mediated chondrogenic commitment of stem cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (6), 7531-7550 (2022).
- Nakano, T., Wang, Y. W., Ozimek, L., Sim, J. S. Chemical composition of the infrapatellar fat pad of swine. Journal of Anatomy. 204 (4), 301-306 (2004).
- Sun, Y., Chen, S., Pei, M. Comparative advantages of infrapatellar fat pad: an emerging stem cell source for regenerative medicine. Rheumatology. 57 (12), 2072-2086 (2018).
- Han, W., et al. Infrapatellar fat pad in the knee: is local fat good or bad for knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 16 (4), 1-8 (2014).
- Bae, S. H., et al. L-ascorbic acid 2-phosphate and fibroblast growth factor-2 treatment maintains differentiation potential in bone marrow-derived mesenchymal stem cells through expression of hepatocyte growth factor. Growth Factors. 33 (2), 71-78 (2015).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Jing, W., et al. Explant culture: an efficient method to isolate adipose-derived stromal cells for tissue engineering. Artificial Organs. 35 (2), 105-112 (2011).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
- Toghraie, F., et al. Treatment of osteoarthritis with infrapatellar fat pad derived mesenchymal stem cells in Rabbit. The Knee. 18 (2), 71-75 (2011).
- Chen, H. -H., et al. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cell product for treatment of knee osteoarthritis: a first-in-human study with evaluation of the potency marker. Cytotherapy. 24 (1), 72-85 (2022).
- Kouroupis, D., Bowles, A. C., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. CD10/Neprilysin enrichment in infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cells under regulatory-compliant conditions: implications for efficient synovitis and fat pad fibrosis reversal. The American Journal of Sports Medicine. 48 (8), 2013 (2020).
