Quantifier les interactions de liaison entre le Cu(II) et les résidus peptidiques en présence et en absence de chromophores

Summary

Cet article se concentre sur l’utilisation de la spectroscopie d’absorption électronique et de la calorimétrie de titrage isotherme pour sonder et quantifier la thermodynamique de la liaison du Cu(II) aux peptides et aux protéines.

Abstract

Le cuivre(II) est un métal essentiel dans les systèmes biologiques, conférant des propriétés chimiques uniques aux biomolécules avec lesquelles il interagit. Il a été rapporté qu’il se lie directement à une variété de peptides et joue des rôles à la fois nécessaires et pathologiques allant de la structure médiatrice aux propriétés de transfert d’électrons en passant par la transmission de la fonction catalytique. La quantification de l’affinité de liaison et de la thermodynamique de ces complexes Cu(II)-peptide in vitro donne un aperçu de la force motrice thermodynamique de la liaison, des compétitions potentielles entre différents ions métalliques pour le peptide ou entre différents peptides pour Cu(II), et de la prévalence du complexe Cu(II)-peptide in vivo. Cependant, la quantification de la thermodynamique de liaison peut être difficile en raison d’une myriade de facteurs, y compris la prise en compte de tous les équilibres concurrents dans une expérience de titrage, en particulier dans les cas où il y a un manque de poignées spectroscopiques discrètes représentant le peptide, l’ion métallique d-bloc et leurs interactions.

Ici, un ensemble robuste d’expériences est fourni pour la quantification précise de la thermodynamique des peptides Cu(II). Cet article se concentre sur l’utilisation de la spectroscopie d’absorption électronique en présence et en l’absence de ligands chromophoriques pour fournir la poignée spectroscopique nécessaire sur Cu(II) et l’utilisation de la calorimétrie de titrage isotherme sans étiquette. Dans les deux techniques expérimentales, un processus est décrit pour tenir compte de tous les équilibres concurrents. Bien que cet article se concentre sur le Cu(II), l’ensemble d’expériences décrites peut s’appliquer au-delà des interactions Cu(II)-peptide et fournir un cadre pour une quantification précise d’autres systèmes métal-peptide dans des conditions physiologiquement pertinentes.

Introduction

La biologie a évolué pour utiliser la chimie diversifiée des ions métalliques nécessaires à l’adaptation et à la survie de la vie dans son environnement. On estime que 25% à 50% des protéines utilisent des ions métalliques pour la structure et la fonction¹. Le rôle particulier et l’état redox de l’ion métallique sont directement liés à la composition et à la géométrie des ligands biologiques qui le coordonnent. En outre, les ions métalliques redox-actifs tels que Cu(II) doivent être étroitement régulés de peur qu’ils n’interagissent avec les agents oxydants via une chimie de type Fenton pour former des espèces réactives de l’oxygène (ROS)^2,3,4. Comprendre les modes de liaison et l’affinité qui sous-tendent sa biochimie devrait aider à élucider le rôle biologique de l’ion métallique.

De nombreuses techniques sont utilisées pour étudier les interactions de liaison des métaux et des peptides. Il s’agit principalement de techniques spectroscopiques, mais elles comprennent également des simulations informatiques utilisant la dynamique moléculaire, comme en témoignent les interactions Cu(II) avec un fragment de bêta-amyloïde (Aβ)⁵. Une technique spectroscopique largement utilisée et accessible à de nombreuses universités est la résonance magnétique nucléaire (RMN). En utilisant la nature paramagnétique de Cu(II), Gaggelli et al. ont pu montrer où l’ion métallique se lie sur un pétide par relaxation des noyaux voisins⁶. La résonance paramagnétique électronique (EPR) peut également être utilisée pour sonder l’emplacement et le mode de liaison des ions métalliques paramagnétiques⁷. D’autres techniques spectroscopiques telles que le dichroïsme circulaire (CD) peuvent décrire la coordination autour de Cu(II) dans des systèmes tels que les systèmes tripeptides⁸, et la spectrométrie de masse peut montrer la stœchiométrie et les résidus auxquels l’ion métallique est coordonné par des modèles de fragmentation ^9,10.

Certaines de ces techniques, telles que la RMN, sont sans étiquette, mais nécessitent de grandes concentrations de peptides, ce qui pose des défis pour l’étude. Une autre technique courante appelée spectroscopie de fluorescence a été utilisée pour relier la position d’une tyrosine ou d’un tryptophane à la trempe à partir d’un Cu(II)^11,12. De même, cette technique peut montrer des changements structurels à la suite de la liaison Cu(II)¹³. Cependant, les défis avec ces études de liaison métal-peptide sont qu’ils sondent les acides aminés chromophoriques tels que la tyrosine que tous les systèmes n’ont pas, que l’ion métallique se lie sous un modèle classique, et que la technique peut ne pas être propice dans des conditions physiologiques. En effet, plusieurs peptides émergent qui ne contiennent pas de tels acides aminés chromophoriques ou se lient selon les modèles classiques, empêchant l’utilisation de ces techniques^14,15. Cet article détaille les approches pour évaluer les propriétés de liaison dans ces scénarios dans des conditions physiologiquement pertinentes.

Les ligands biologiques peuvent adopter différents états de protonation qui peuvent affecter la liaison aux ions métalliques tels que l’anneau imidazole sur l’histidine. Si le pH n’est pas maintenu de manière constante, les résultats peuvent être alambiqués ou contradictoires. Pour cette raison, les tampons sont un composant essentiel dans l’étude des interactions métal-protéine/peptide. Cependant, il a été démontré que de nombreux tampons interagissent favorablement avec les ions métalliques^16,17. En plus de rivaliser avec la molécule biologique d’intérêt, le tampon peut avoir des atomes de coordination similaires qui peuvent être difficiles à distinguer des atomes de coordination du peptide ou de la protéine. Dans cette étude, l’accent est mis sur la spectroscopie d’absorption électronique et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) en tant que deux techniques complémentaires pour étudier les interactions Cu(II)-peptide, avec des considérations particulières concernant le choix du tampon.

La spectroscopie d’absorption électronique est une technique rapide et largement accessible pour étudier les interactions de liaison des métaux. L’irradiation avec de la lumière dans les longueurs d’onde ultraviolettes (UV) ou visibles peut entraîner l’absorption de bandes d-d centrées sur le métal, qui fournissent des informations précieuses sur la classification des ligands, les géométries des métaux et les affinités de liaison apparentes^18,19. Pour ces complexes, les titrages directs d’ions métalliques dans des solutions protéiques ou peptidiques peuvent quantifier les stœchiométries de liaison et les affinités de liaison apparentes. Dans certains cas, comme les configurations d’électrons d⁵ ou d¹⁰, le complexe n’absorbe pas la lumière (c.-à-d. est spectroscopiquement silencieux). Dans ces complexes de métaux de transition spectroscopiquement silencieux, ces limitations peuvent être contournées en utilisant un ligand concurrent qui, lors de la coordination avec l’ion métallique, donne des bandes de transfert de charge détectables. Dans les deux cas, cette approche se limite à quantifier uniquement la stœchiométrie et l’affinité de liaison apparente, et aucun aperçu de l’enthalpie de liaison n’est fourni sans approximations.

Complétant les informations obtenues par spectroscopie d’absorption électronique, l’ITC est une technique attrayante pour la quantification directe et rigoureuse de l’enthalpie de liaison²⁰. L’ITC mesure directement la chaleur libérée ou consommée lors d’un événement de liaison et, puisque le titrage a lieu à pression constante, la chaleur mesurée est l’enthalpie de tous les équilibres (ΔH_ITC). De plus, la stœchiométrie de l’événement de liaison (n) et l’affinité de liaison apparente (K_ITC) sont quantifiées. À partir de ces paramètres, l’énergie libre (ΔG_ITC) et l’entropie (ΔS_ITC) sont déterminées, fournissant un instantané thermodynamique de l’événement de liaison. Comme il ne repose pas sur l’absorption de la lumière, l’ITC est une technique idéale pour les espèces spectroscopiquement silencieuses, par exemple, les complexes d’ions métalliques d⁵ ou d¹⁰ . Cependant, étant donné que la calorimétrie mesure la chaleur, tout système tampon non apparié et tout équilibre non comptabilisé peuvent nuire à l’analyse visant à déterminer avec précision la thermodynamique de liaison aux ions métalliques, et il faut prendre grand soin de traiter ces facteurs²⁰. S’il est effectué avec la rigueur appropriée, l’ITC est une technique robuste pour déterminer la thermodynamique des complexes métal-protéine/peptide.

Ici, un peptide de liaison au cuivre chromophoriquement silencieux, le C-peptide, est utilisé pour démontrer l’utilisation complémentaire des deux techniques. Le peptide C est un produit de clivage de 31 résidus (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) formé pendant la maturation de l’insuline; il manque de résidus chromophoriques mais il a été démontré qu’il lie le Cu(II) avec une affinité physiologiquement pertinente^14,15. Le site de liaison Cu(II) est constitué des chaînes latérales d’un glutamate et d’un aspartate ainsi que du N-terminus du peptide^14,15. Ces atomes de coordination ressemblent beaucoup à ceux de nombreux systèmes tampons couramment utilisés. Ici, l’utilisation en tandem des bandes d-d et de transfert de charge en spectroscopie d’absorption électronique et ITC dans la quantification de la thermodynamique de liaison Cu(II) au peptide C est montrée. L’approche de l’étude de la liaison Cu(II) au peptide C peut être appliquée à d’autres ions métalliques et systèmes protéine/peptide.

Protocol

1. Spectroscopie d’absorption électronique : titrage direct avec compétition tampon Préparation des échantillons Préparer une solution tamponnée de 50 mM de 2-[bis(2-hydroxyéthyl)amino]-2-(hydroxyméthyl)propane-1,3-diol (bisTris) à pH 7,4 en utilisant de l’eau ultrapure (résistance >18 MΩ). Éliminer les ions métalliques traces en incubant avec une résine à haute affinité pendant au moins 2 h avec filtration ultérieure. Dissoudre ou diluer une quantité co…

Representative Results

L’objectif était de quantifier et de corroborer la thermodynamique de la liaison du Cu(II) au peptide C en utilisant les techniques complémentaires de spectroscopie d’absorption électronique et d’ITC. En raison de la nature robuste de la spectroscopie d’absorption électronique, un titrage direct de Cu(II) en peptide C de 300 μM a été effectué (Figure 1). L’ajout de 150 μM de Cu(II) a provoqué une augmentation immédiate de la bande à 600 nm, attribuée à la bande d-d de…

Discussion

Cet article fournit une méthode robuste pour quantifier l’affinité et la thermodynamique de la liaison cu(II) aux peptides. Les complexes avec Cu(II) sont parfaitement adaptés pour surveiller la bande d’absorption d-d sur le site métallique en raison de sa configuration électronique d⁹ . Bien que le coefficient d’extinction soit faible, nécessitant ainsi de plus grandes concentrations du complexe pour produire un signal fiable, les titrages de Cu(II) en peptide peuvent rapidement fournir un aperçu…

Materials

1,10-phenanthroline	Sigma Aldrich	131377-25G
bis-Tris buffer	Fisher	BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane	Nalgene	296-4545	Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer	Varian	Cary 5000	Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin	Sigma Aldrich	C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC)	TA Instruments	Nano ITC Low Volume
ITC analysis software	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software	TA Instruments	ITCRun
light-duty delicate wiper	Kimwipe	34155
loading syringe	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20	Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer	Alfa Aesar	A12914
spectrophotometer software	Cary	WinUV Scan
spreadsheet program	Microsoft	Excel	Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe	TA Instruments	5346
ultrapure water	Millipore Sigma	Milli-Q	Any water is okay as long as >18 MΩ resistance