발색단의 존재 및 부재 하에 Cu(II)와 펩티드 잔기 사이의 결합 상호작용을 정량화하기
Summary
이 기사는 펩티드 및 단백질에 결합하는 Cu (II)의 열역학을 조사하고 정량화하기 위해 전자 흡수 분광법 및 등온 적정 열량계의 사용에 중점을 둡니다.
Abstract
구리(II)는 생물학적 시스템에서 필수적인 금속으로, 그것이 상호작용하는 생체분자에 독특한 화학적 성질을 부여한다. 다양한 펩타이드에 직접 결합하고 매개구조에서 전자전달 특성, 촉매 기능 부여에 이르기까지 필요하고 병리학적인 역할을 모두 수행하는 것으로 보고되었다. 시험관 내에서 이러한 Cu(II)-펩티드 복합체의 결합 친화도 및 열역학을 정량화하는 것은 결합의 열역학적 추진력, 펩티드에 대한 상이한 금속 이온 사이의 또는 Cu(II)에 대한 상이한 펩티드 사이의 잠재적 경쟁, 및 생체내에서 Cu(II)-펩티드 복합체의 보급에 대한 통찰력을 제공한다. 그러나, 결합 열역학을 정량화하는 것은 적정 실험 내의 모든 경쟁 평형을 고려하는 것을 포함하여 무수한 요인들로 인해 어려울 수 있으며, 특히 펩티드, d-블록 금속 이온 및 이들의 상호작용을 나타내는 이산 분광학적 핸들이 부족한 경우에 더욱 그러하다.
여기에서, Cu(II)-펩티드 열역학의 정확한 정량화를 위한 강력한 실험 세트가 제공된다. 이 기사는 Cu (II)에 필요한 분광학적 핸들을 제공하고 라벨이없는 등온 적정 열량계의 사용을 제공하기 위해 염색체 리간드의 유무에 전자 흡수 분광법을 사용하는 데 중점을 둡니다. 두 실험 기술 모두에서, 모든 경쟁 평형을 설명하기 위해 프로세스가 설명된다. 이 기사의 초점은 Cu (II)에 있지만, 설명 된 일련의 실험은 Cu (II) – 펩티드 상호 작용을 넘어 적용 할 수 있으며 생리 학적 관련 조건 하에서 다른 금속 – 펩티드 시스템의 정확한 정량화를위한 프레임 워크를 제공 할 수 있습니다.
Introduction
생물학은 생명체가 주변 환경에 적응하고 생존하는 데 필요한 금속 이온의 다양한 화학을 활용하도록 진화했습니다. 단백질의 약 25%-50%가 구조와 기능을 위해 금속 이온을 사용한다1. 금속 이온의 특정 역할 및 산화환원 상태는 이를 배위하는 생물학적 리간드의 조성 및 기하학적 구조와 직접적으로 관련된다. 또한, Cu(II)와 같은 산화환원 활성 금속 이온은 반응성 산소 종(ROS)2,3,4를 형성하기 위해 펜톤과 같은 화학을 통해 산화제와 상호작용하지 않도록 엄격하게 조절되어야 한다. 생화학을 주도하는 결합 모드와 친화도를 이해하면 금속 이온의 생물학적 역할을 밝히는 데 도움이됩니다.
많은 기술이 금속과 펩티드의 결합 상호작용을 연구하기 위해 사용된다. 이들은 대부분 분광학적 기술이지만 아밀로이드 베타 (Aβ)5의 단편과의 Cu (II) 상호 작용을 통해 볼 수 있듯이 분자 역학을 사용하는 컴퓨터 시뮬레이션도 포함합니다. 많은 대학에서 접근 할 수있는 널리 사용되는 분광 기술은 핵 자기 공명 (NMR)입니다. Cu (II)의 상자성 성질을 사용함으로써, Gaggelli et al.은 근처의 핵6의 이완을 통해 금속 이온이 잎자루에 결합하는 곳을 보여줄 수있었습니다. 전자 상자성 공명(EPR)은 또한 상자성 금속 이온 결합(7)의 위치 및 모드를 프로브하는데 이용될 수 있다. 원형 이색성(CD)과 같은 다른 분광학적 기술은 트리펩타이드 시스템(8)과 같은 시스템에서 Cu(II)에 대한 배위를 기술할 수 있고, 질량 분광법은 화학량론적 및 금속 이온의 잔기가 단편화 패턴(9,10)을 통해 배위되는 것을 보여줄 수 있다.
NMR과 같은 이러한 기술 중 일부는 라벨이 없지만 많은 농도의 펩타이드가 필요하므로 연구에 어려움을 초래합니다. 형광 분광법(fluorescence spectroscopy)이라고 불리는 또 다른 일반적인 기술은 티로신 또는 트립토판의 위치를 Cu(II)11,12로부터의 담금질과 관련시키기 위해 이용되었다. 유사하게, 이 기술은 Cu(II) 결합(13)의 결과로서 구조적 변화를 보여줄 수 있다. 그러나 이러한 금속-펩티드 결합 연구의 과제는 모든 시스템이 가지고 있지 않은 티로신과 같은 염색체 아미노산을 프로브하고, 금속 이온이 고전적인 모델 하에서 결합하며, 이 기술이 생리적 조건 하에서 도움이 되지 않을 수 있다는 것이다. 실제로, 이러한 염색체 아미노산을 함유하지 않거나 고전적 모델 하에서 결합하지 않는 몇몇 펩티드가 출현하고 있으며, 이러한 기술(14,15)의 사용을 배제하고 있다. 이 기사에서는 생리학적으로 관련된 조건에서 이러한 시나리오에서 결합 특성을 평가하기 위한 접근 방식을 자세히 설명합니다.
생물학적 리간드는 히스티딘 상의 이미다졸 고리와 같은 금속 이온 결합에 영향을 미칠 수 있는 상이한 양성자화 상태를 채택할 수 있다. pH가 일관되게 유지되지 않으면 결과가 복잡하거나 충돌할 수 있습니다. 이러한 이유로 버퍼는 금속 – 단백질 / 펩티드 상호 작용 연구에 필수적인 구성 요소입니다. 그러나, 많은 완충제들이 금속 이온들(16,17)과 호의적으로 상호작용하는 것으로 나타났다. 관심있는 생물학적 분자와 경쟁하는 것에 더하여, 완충제는 펩티드 또는 단백질의 배위 원자와 구별하기 어려울 수 있는 유사한 배위 원자를 가질 수 있다. 이 연구에서는 Cu (II) – 펩티드 상호 작용을 연구하기위한 두 가지 보완 기술로서 전자 흡수 분광법 및 등온 적정 열량계 (ITC)에 중점을두고 있으며 버퍼 선택과 관련하여 특별한 고려 사항이 있습니다.
전자 흡수 분광법은 금속 결합 상호 작용을 연구하기위한 빠르고 널리 접근 가능한 기술입니다. 자외선(UV) 또는 가시광선 파장에서 광을 조사하면 리간드 분류, 금속 기하학적 및 명백한 결합 친화도18,19에 대한 귀중한 정보를 제공하는 금속 중심 d-d 밴드의 흡수를 유도할 수 있습니다. 이러한 복합체의 경우, 금속 이온을 단백질 또는 펩티드 용액으로 직접 적정하면 결합 화학량론과 명백한 결합 친화도를 정량화할 수 있습니다. d5 또는d10 전자 구성과 같은 일부 경우에, 복합체는 광을 흡수하지 않는다(즉, 분광학적으로 침묵한다). 이러한 분광학적으로 침묵하는 전이 금속 착물에서, 이러한 제한은 금속 이온에 배위될 때, 검출가능한 전하 전달 밴드를 산출하는 경쟁 리간드를 사용함으로써 회피될 수 있다. 두 경우 모두 이 접근법은 화학량론과 명백한 결합 친화도만을 정량화하는 것으로 제한되며, 근사치 없이는 결합 엔탈피에 대한 통찰력이 제공되지 않습니다.
전자 흡수 분광법으로부터 얻은 정보를 보완하는 ITC는 결합 엔탈피(20)의 직접적이고 엄격한 정량화를 위한 매력적인 기술이다. ITC는 결합 이벤트 동안 방출되거나 소비되는 열을 직접 측정하고, 적정이 일정한 압력에서 일어나기 때문에, 측정된 열은 모든 평형(ΔHITC)의 엔탈피이다. 또한, 결합 사건 (n) 및 겉보기 결합 친화도 (KITC)의 화학량론이 정량화된다. 이들 파라미터로부터, 자유 에너지(ΔG ITC) 및 엔트로피(ΔSITC)가 결정되어, 결합 이벤트의 열역학적 스냅샷을 제공한다. 광 흡수에 의존하지 않기 때문에, ITC는 분광학적으로 침묵하는 종, 예를 들어,d5 또는d10 금속 이온 착물에 이상적인 기술이다. 그러나, 열량계가 열을 측정하기 때문에, 임의의 타의 추종을 불허하는 완충 시스템 및 설명되지 않은 평형은 금속 이온 결합 열역학을 정확하게 결정하기 위해 분석에 악영향을 미칠 수 있고, 이들 인자(20)를 다루기 위해 세심한 주의를 기울여야 한다. 적절한 엄격함으로 수행되는 경우, ITC는 금속-단백질/펩티드 복합체의 열역학을 결정하기 위한 강력한 기술입니다.
여기서, 염색체적으로 침묵하는 구리-결합 펩티드, C-펩티드는 두 기술의 상보적인 사용을 입증하기 위해 사용된다. C-펩티드는 인슐린 성숙 동안 형성된 31개의 잔기 절단 생성물 (EAEDLQVGQVELGPGAGSLQPLALEGSLQ)이고; 그것은 염색체 잔기가 부족하지만 Cu (II)를 생리 학적 관련 친화력14,15와 결합하는 것으로 나타났습니다. Cu(II) 결합 부위는 글루타메이트와 아스파르테이트의 측쇄 뿐만 아니라 펩티드14,15의 N 말단으로 구성된다. 이러한 조정 원자는 일반적으로 사용되는 많은 완충 시스템의 원자와 매우 유사합니다. 여기서, C-펩티드에 대한 Cu(II) 결합 열역학을 정량화하기 위한 전자 흡수 분광법 및 ITC에서의 d-d 및 전하 전달 밴드의 탠덤 사용이 도시되어 있다. C-펩티드에 대한 Cu(II) 결합을 연구하는 접근법은 다른 금속 이온 및 단백질/펩티드 시스템에 적용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 글은 펩티드에 대한 Cu(II) 결합의 친화도 및 열역학을 정량화하기 위한 강력한 방법을 제공한다. Cu(II)를 갖는 착물은d9 전자 구성으로 인해 금속 부위에서 d-d 흡수 밴드를 모니터링하는 데 이상적으로 적합하다. 비록 소멸 계수가 작고, 따라서 신뢰할 수 있는 신호를 산출하기 위해 복합체의 더 큰 농도가 필요하지만, 펩티드로의 Cu(II)의 적정은 결합 화학량론과 근사 결합 친화도에 대한…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SC는 Whitehead Summer Research Fellowship에 감사드립니다. MJS는 샌프란시스코 대학의 스타트업 펀드와 교수 개발 기금에 감사를 표합니다. MCH는 국립 보건원 (NIH MIRA 5R35GM133684-02)과 국립 과학 재단 (NSF CAREER 2048265)의 기금을 인정합니다.
Materials
| 1,10-phenanthroline | Sigma Aldrich | 131377-25G | |
| bis-Tris buffer | Fisher | BP301-100 | |
| Bottle-top 0.45 micron membrane | Nalgene | 296-4545 | Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable |
| Copper(II) chloride | Alfa Aesar | 12458 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Electronic absorption spectrophotometer | Varian | Cary 5000 | Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable |
| high affinity resin | Sigma Aldrich | C7901-25G | |
| Isothermal titration calorimeter (ITC) | TA Instruments | Nano ITC Low Volume | |
| ITC analysis software | TA Instruments | NanoAnalyze | SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used |
| ITC software | TA Instruments | ITCRun | |
| light-duty delicate wiper | Kimwipe | 34155 | |
| loading syringe | Hamilton | Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL | |
| matched cuvettes | Starna Cells, Inc | 16.100-Q-10/Z20 | Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer |
| MOPS buffer | Alfa Aesar | A12914 | |
| spectrophotometer software | Cary | WinUV Scan | |
| spreadsheet program | Microsoft | Excel | Any suitable spreadsheet program will work |
| titration syringe | TA Instruments | 5346 | |
| ultrapure water | Millipore Sigma | Milli-Q | Any water is okay as long as >18 MΩ resistance |
References
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