Quantificare le interazioni di legame tra Cu(II) e residui peptidici in presenza e assenza di cromofori

Summary

Questo articolo si concentra sull’uso della spettroscopia di assorbimento elettronica e della calorimetria di titolazione isotermica per sondare e quantificare la termodinamica del legame di Cu(II) a peptidi e proteine.

Abstract

Il rame (II) è un metallo essenziale nei sistemi biologici, conferendo proprietà chimiche uniche alle biomolecole con cui interagisce. È stato riportato che si lega direttamente a una varietà di peptidi e svolge ruoli sia necessari che patologici che vanno dalla struttura mediatrice alle proprietà di trasferimento degli elettroni all’impartire la funzione catalitica. Quantificare l’affinità di legame e la termodinamica di questi complessi peptidici Cu(II) in vitro fornisce informazioni sulla forza motrice termodinamica del legame, sulle potenziali competizioni tra diversi ioni metallici per il peptide o tra diversi peptidi per Cu(II) e sulla prevalenza del complesso Cu(II)-peptide in vivo. Tuttavia, quantificare la termodinamica di legame può essere difficile a causa di una miriade di fattori, tra cui la contabilità di tutti gli equilibri concorrenti all’interno di un esperimento di titolazione, specialmente nei casi in cui vi è una mancanza di maniglie spettroscopiche discrete che rappresentano il peptide, lo ione metallico d-block e le loro interazioni.

Qui, viene fornita una robusta serie di esperimenti per la quantificazione accurata della termodinamica del peptide Cu(II). Questo articolo si concentra sull’uso della spettroscopia di assorbimento elettronico in presenza e assenza di ligandi cromoforici per fornire la necessaria maniglia spettroscopica su Cu (II) e l’uso della calorimetria isotermica a titolazione senza etichetta. In entrambe le tecniche sperimentali, viene descritto un processo per tenere conto di tutti gli equilibri concorrenti. Mentre il focus di questo articolo è su Cu(II), l’insieme descritto di esperimenti può applicarsi oltre le interazioni Cu(II)-peptide e fornire un quadro per una quantificazione accurata di altri sistemi metallo-peptidi in condizioni fisiologicamente rilevanti.

Introduction

La biologia si è evoluta per utilizzare la diversa chimica degli ioni metallici necessari alla vita per adattarsi e sopravvivere nell’ambiente circostante. Si stima che il 25%-50% delle proteine utilizzi ioni metallici per la struttura e la funzione¹. Il particolare ruolo e stato redox dello ione metallico è direttamente correlato alla composizione e alla geometria dei ligandi biologici che lo coordinano. Inoltre, gli ioni metallici redox-attivi come Cu(II) devono essere strettamente regolati per timore che interagiscano con agenti ossidanti attraverso la chimica simile a Fenton per formare specie reattive dell’ossigeno (ROS)^2,3,4. Comprendere i modi di legame e l’affinità che guidano la sua biochimica dovrebbe aiutare a chiarire il ruolo biologico dello ione metallico.

Molte tecniche sono utilizzate per studiare le interazioni di legame di metalli e peptidi. Queste sono per lo più tecniche spettroscopiche, ma includono anche simulazioni al computer che utilizzano la dinamica molecolare, come visto attraverso le interazioni Cu (II) con un frammento di amiloide-beta (Aβ) ⁵. Una tecnica spettroscopica ampiamente utilizzata che è accessibile a molte università è la risonanza magnetica nucleare (NMR). Usando la natura paramagnetica di Cu(II), Gaggelli et al. sono stati in grado di mostrare dove lo ione metallico si lega su un petide attraverso il rilassamento dei nuclei vicini⁶. La risonanza paramagnetica elettronica (EPR) può anche essere utilizzata per sondare la posizione e la modalità del legame ionico metallico paramagnetico⁷. Altre tecniche spettroscopiche come il dicroismo circolare (CD) possono descrivere il coordinamento su Cu(II) in sistemi come i sistemi tripartitici⁸, e la spettrometria di massa può mostrare stechiometria e a quali residui lo ione metallico è coordinato attraverso modelli di frammentazione ^9,10.

Alcune di queste tecniche, come la NMR, sono prive di etichette ma richiedono grandi concentrazioni di peptide, ponendo sfide per lo studio. Un’altra tecnica comune chiamata spettroscopia di fluorescenza è stata utilizzata per mettere in relazione la posizione di una tirosina o triptofano con la tempra da un Cu(II)^11,12. Allo stesso modo, questa tecnica può mostrare cambiamenti strutturali come risultato del legame Cu(II)¹³. Tuttavia, le sfide con questi studi di legame metallo-peptide sono che sondano gli amminoacidi cromoforici come la tirosina che non tutti i sistemi hanno, che lo ione metallico si lega sotto un modello classico e che la tecnica potrebbe non essere favorevole in condizioni fisiologiche. In effetti, stanno emergendo diversi peptidi che non contengono tali amminoacidi cromoforici o si legano sotto modelli classici, precludendo l’uso di queste tecniche^14,15. Questo articolo descrive in dettaglio gli approcci per valutare le proprietà di legame in questi scenari in condizioni fisiologicamente rilevanti.

I ligandi biologici possono adottare diversi stati di protonazione che possono influenzare il legame con ioni metallici come l’anello imidazolo sull’istidina. Se il pH non viene mantenuto in modo coerente, i risultati possono essere contorti o conflittuali. Per questo motivo, i tamponi sono una componente essenziale nello studio delle interazioni metallo-proteina/peptide. Tuttavia, molti buffer hanno dimostrato di interagire favorevolmente con gli ioni metallici^16,17. Oltre a competere con la molecola biologica di interesse, il buffer può avere atomi di coordinamento simili che possono essere difficili da distinguere dagli atomi coordinati del peptide o della proteina. In questo studio, l’attenzione si concentra sulla spettroscopia di assorbimento elettronico e sulla calorimetria a titolazione isotermica (ITC) come due tecniche complementari per lo studio delle interazioni Cu(II)-peptide, con considerazioni speciali riguardanti la scelta del tampone.

La spettroscopia elettronica di assorbimento è una tecnica rapida e ampiamente accessibile per lo studio delle interazioni metallo-legame. L’irradiazione con la luce nelle lunghezze d’onda ultraviolette (UV) o visibili può portare all’assorbimento di bande d-d centrate sul metallo, che forniscono preziose informazioni sulla classificazione dei ligandi, sulle geometrie dei metalli e sulle apparenti affinità di legame^18,19. Per questi complessi, le titolazioni dirette di ioni metallici in soluzioni proteiche o peptidiche possono quantificare le stechiometrie di legame e le apparenti affinità di legame. In alcuni casi, come le configurazioni di elettroni d⁵ o d¹⁰, il complesso non assorbe la luce (cioè è spettroscopicamente silenzioso). In questi complessi di metalli di transizione spettroscopicamente silenziosi, queste limitazioni possono essere aggirate utilizzando un ligando concorrente che, coordinandosi con lo ione metallico, produce bande di trasferimento di carica rilevabili. In entrambi i casi, questo approccio si limita a quantificare solo la stechiometria e l’apparente affinità di legame, e nessuna comprensione dell’entalpia di legame è fornita senza approssimazioni.

Integrando le informazioni ottenute dalla spettroscopia elettronica di assorbimento, l’ITC è una tecnica interessante per la quantificazione diretta e rigorosa dell’entalpia^{di legame 20}. ITC misura direttamente il calore rilasciato o consumato durante un evento legante e, poiché la titolazione avviene a pressione costante, il calore misurato è l’entalpia di tutti gli equilibri (ΔH_ITC). Inoltre, la stechiometria dell’evento di legame (n) e l’apparente affinità di legame (K_ITC) sono quantificate. Da questi parametri vengono determinate l’energia libera (ΔG_ITC) e l’entropia (ΔS_ITC), fornendo un’istantanea termodinamica dell’evento di legame. Poiché non si basa sull’assorbimento della luce, ITC è una tecnica ideale per specie spettroscopicamente silenziose, ad esempio complessi di ioni metallici d⁵ o d¹⁰ . Tuttavia, poiché la calorimetria misura il calore, qualsiasi sistema tampone senza pari e gli equilibri non contabilizzati possono influire negativamente sull’analisi per determinare con precisione la termodinamica legante gli ioni metallici e occorre prestare molta attenzione per affrontare questi fattori²⁰. Se eseguita con il rigore appropriato, l’ITC è una tecnica robusta per determinare la termodinamica dei complessi metallo-proteina/peptide.

Qui, un peptide legante il rame cromoforicamente silenzioso, il peptide C, viene utilizzato per dimostrare l’uso complementare delle due tecniche. Il peptide C è un prodotto di scissione di 31 residui (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) formato durante la maturazione dell’insulina; manca di residui cromoforici ma ha dimostrato di legare Cu(II) con affinità fisiologicamente rilevante^14,15. Il sito di legame Cu(II) è costituito dalle catene laterali di un glutammato e di un aspartato, nonché dall’N-terminale del peptide^14,15. Questi atomi di coordinamento assomigliano molto a quelli di molti sistemi tamponati comunemente usati. Qui, viene mostrato l’uso in tandem delle bande d-d e di trasferimento di carica nella spettroscopia elettronica di assorbimento e ITC nel quantificare la termodinamica di legame Cu(II) al peptide C. L’approccio derivante dallo studio del legame di Cu(II) al peptide C può essere applicato ad altri ioni metallici e sistemi proteici/peptidici.

Protocol

1. Spettroscopia elettronica di assorbimento: titolazione diretta con competizione tampone Preparazione del campione Preparare una soluzione tamponata di 50 mM 2-[bis(2-idrossietil)ammino]-2-(idrossimetil)propano-1,3-diolo (bisTris) a pH 7,4 utilizzando acqua ultrapura (resistenza >18 MΩ). Rimuovere gli ioni metallici in traccia incubandoli con una resina ad alta affinità per almeno 2 ore con successiva filtrazione. Sciogliere o diluire una quantità nota del peptide nel ta…

Representative Results

L’obiettivo era quello di quantificare e corroborare la termodinamica del legame di Cu(II) al peptide C utilizzando le tecniche complementari della spettroscopia elettronica di assorbimento e dell’ITC. A causa della natura robusta della spettroscopia elettronica di assorbimento, è stata eseguita una titolazione diretta di Cu(II) in 300 μM di peptide C (Figura 1). L’aggiunta di 150 μM di Cu(II) ha causato un immediato aumento della banda a 600 nm, attribuito alla banda d-d di Cu(II), e ha …

Discussion

Questo articolo fornisce un metodo robusto per quantificare l’affinità e la termodinamica del legame di Cu(II) ai peptidi. I complessi con Cu(II) sono ideali per monitorare la banda di assorbimento d-d nel sito metallico grazie alla sua configurazione di elettroni d⁹ . Sebbene il coefficiente di estinzione sia piccolo, richiedendo quindi concentrazioni maggiori del complesso per produrre un segnale affidabile, le titolazioni di Cu(II) in peptide possono fornire rapidamente informazioni sulla stechiometria di …

Materials

1,10-phenanthroline	Sigma Aldrich	131377-25G
bis-Tris buffer	Fisher	BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane	Nalgene	296-4545	Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer	Varian	Cary 5000	Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin	Sigma Aldrich	C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC)	TA Instruments	Nano ITC Low Volume
ITC analysis software	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software	TA Instruments	ITCRun
light-duty delicate wiper	Kimwipe	34155
loading syringe	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20	Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer	Alfa Aesar	A12914
spectrophotometer software	Cary	WinUV Scan
spreadsheet program	Microsoft	Excel	Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe	TA Instruments	5346
ultrapure water	Millipore Sigma	Milli-Q	Any water is okay as long as >18 MΩ resistance