Summary

בידוד של עורקים תוך-ריאתיים ותאי שריר חלק כדי לחקור תגובות כלי דם

Published: June 08, 2022
doi:

Summary

ניתן לחקור תגובות וסקולריות של זרימת הדם הריאתית העורקית באמצעות עורק תוך פולמונרי (IPA) ותאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs). המחקר הנוכחי מתאר בפירוט את הבידוד של IPA ואת הפרוטוקולים המשמשים לחקר vasorelaxation בתגובה לגירויים פיזיולוגיים.

Abstract

ניתן להשתמש בעורק התוך-ריאתי (IPA) ובתאי השריר החלק של כלי הדם (VSMCs) שבודדו מריאות חולדות כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של התפשטות כלי דם ו-vasorelax. לאחר בידוד ה- IPA וה- VSMCs, ניתן להעריך את המאפיינים של תגובות כלי הדם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים בהעדר גורמים חיצוניים כגון אותות עצביים, הורמונים, ציטוקינים וכו ‘. לפיכך, ה- IPA וה- VSMCs משמשים מודלים מצוינים לחקר פיזיולוגיה / פתופיזיולוגיה של כלי הדם, יחד עם חקירות ניסיוניות שונות, כגון אפנון על ידי סוכנים פרמקולוגיים, ניתוח אלקטרופיזיולוגי של מהדק טלאי, הדמיית סידן וכו ‘. כאן, השתמשנו בטכניקה לבידוד ה-IPA כדי לחקור תגובות וסקולריות במערך אמבט איברים. מקטעי IPA הורכבו על תא אמבט האיברים באמצעות חוטים אינטראלומינליים ועוררו על ידי סוכנים פרמקולוגיים שונים. השינויים בטונוס כלי הדם של IPA (כלומר, vasoconstriction ו-vasorelax), תועדו באמצעות מתמר כוח איזומטרי ותוכנה לניתוח נתונים פיזיולוגיים. יישמנו מספר פרוטוקולים ניסיוניים, שניתן להתאים אותם כדי לחקור את המנגנונים של vasorelax/vasoconstriction לחקר הפעילות הפרמקולוגית של תרופות פיטוכימיות או סינתטיות. הפרוטוקולים יכולים לשמש גם להערכת תפקידן של תרופות בוויסות מחלות שונות, כולל יתר לחץ דם ריאתי עורקי. מודל IPA מאפשר לנו לחקור את עקומת תגובת הריכוז, שהיא חיונית בהערכת הפרמטרים הפרמקודינמיים של תרופות.

Introduction

כלי הדם הריאתיים הם מערכת כלי דם בלחץ נמוך שבה הפונקציה העיקרית היא לספק דם deoxygenated לאזור החלפת גז של הריאות. העורקים הריאתיים בריאות מסודרים בענפים מקבילים לעץ הסימפונות, ובסופו של דבר יוצרים רשת נרחבת של נימים שהיא רציפה על פני כמה נאדיות, ולבסוף, מתאחדת לתוך ורידים וורידים. הטון הווסקולרי של עורק הריאה נשלט על ידי מספר גורמים, המערבים את האינטראקציה בין האנדותל לבין תאי השריר החלק של כלי הדם (VSMCs)1.

במחקר זה אנו מתמקדים בכלי הדם התלויים-תלותיים והעצמאיים של העורק התוך-פולמונרי (IPA). בנוגע לווסורגנציה התלויה באנדותל, מנגנונים שונים המתרחשים על פני השטח של תאי האנדותל עשויים להגביר את ריכוז Ca2+ התוך-תאי (לדוגמה, קשירת אצטילכולין [ACh] עם קולטן מוסקריני [M3]), מה שמוביל להיווצרות תחמוצת החנקן (NO), פרוסטציקלין (PGl 2) וגורם היפרפולריזציה שמקורו באנדותל (EDHF) (איור 1 ). NO הוא הגורם המרגיע העיקרי שמקורו באנדותל, המסונתז מ-L-ארגינין על-ידי סינתאז תחמוצת החנקן של האנדותל (eNOS)2, אשר לאחר מכן מתנתק מתאי האנדותל ל-VSMCs (איור 1) וממריץ את האנזים המסיס גואניליל ציקלאז (sGC); האנזים הזה משנה את הגואנוזין טריפוספט (GTP) לגואנוזין מונופוספט מחזורי (cGMP), שמפעיל את החלבון קינאז G (PKG) ומפחית את רמות Ca2+ הציטוזוליקיות, ובכך גורם לדלקת כלי הדם (איור 1). PGl 2 מסונתז על ידי תאי אנדותל דרך מסלול ציקלו-אוקסיגנאז (COX) 3,4. הוא נקשר לקולטן הפרוסטציקלין (IP) ב-VSMCs וממריץ את האנזים אדניליל ציקלאז (AC), אשר לאחר מכן ממיר אדנוזין טריפוספט (ATP) לאדנוזין מונופוספט מחזורי (cAMP) (איור 1)3,4. cAMP מפעיל את החלבון קינאז A (PKA), מפחית את רמות Ca2+ הציטוזולי וגורם לווזורגנציה5 (איור 1). מסלול ה-EDHF משתתף גם בוויסורגנציה תלוית אנדותל באמצעות מתווכי אנדותל שונים ואירועים חשמליים. ההפעלה של מסלול EDHF מובילה להיפרפולריזציה של VSMCs, ובכך סוגרת ערוצי Ca2+ (VOCCs) המופעלים באמצעות מתח, מפחיתה את רמותCa 2+ התוך-תאיות, וגורמת לוויסורגנציה6. הוויסורגנציה הבלתי תלויה באנדותל מתרחשת ישירות על VSMCs באמצעות מספר מנגנונים, כגון הפחתת רמתCa 2+ תוך-תאית, עיכוב של קינאז שרשרת אור מיוזין (MLCK), הפעלת פוספטאז שרשרת אור מיוזין (MLCP), והפחתת רגישות Ca2+ למנגנון ההתכווצות של VSMCs. במחקר זה, אנו מתמקדים בווזורגנציה הנגרמת על ידי פתיחת ערוצי K+ שונים, חסימת תרכובות אורגניות נדיפות ועיכוב שחרור Ca 2+ מהרשתית הסרקופלסמית7, מה שמוביל לירידה ברמות Ca 2+ תוך-תאיות, ובכך מפחית את זרחון שרשרת האור VSMC מיוזין וקשירת מיוזין-אקטין או היווצרות גשר צולב, בהתאמה, ובסופו של דבר התוצאה היא vasorelaxation.

הטכניקה להערכת מדידות vasoconstriction ו vasorelaxation ב IPA מבודד מבוססת היטב עבור מכרסמים, אבל הנתונים השתנו בהתאם לפרוטוקולים הניסוי. המחקר הנוכחי מתאר את השיטה המשמשת להערכת תגובתיות כלי הדם של תכשירי IPA של חולדות במבחנה, שנעשו בהיעדר גורמים חיצוניים המווסתים את תגובת כלי הדם in vivo, כגון אותות עצביים, הורמונים, ציטוקינים, לחץ דם וכו ‘.

השתמשנו במספר פרוטוקולים ניסיוניים תוך שימוש בתמצית הצמח כדוגמה לחקר תגובתיות כלי הדם של IPA. חוסמים שונים (איור 1) שימשו כדי לזהות את המנגנונים של כלי דם תלויי אנדותל ובלתי תלויים המושרים על-ידי תמצית הצמח. עם זאת, ניתן להתאים את אותם פרוטוקולים כדי להעריך את תגובות כלי הדם של IPA לכל תרופות, תמציות או פיטוכימיקלים המשמשים לטיפול בפאתולוגיות ריאתיות שונות.

Protocol

הניסויים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת Naresuan (NUACUC), פרוטוקול מספר NU-AE620921, לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות. 1. הרכב של פתרונות פיזיולוגיים צור תמיסת קרבס על ידי המסת כימיקלים במים מזוקקים כדי להשיג…

Representative Results

הפרוטוקול במחקר הנוכחי פותח כדי לקבוע את תנאי הניסוי האופטימליים למדידת תופעות פיזיולוגיות שנצפו בתגובות כלי הדם של תכשירי IPA מבודדים. ניסויי הפיילוט בוצעו כדי לתאר את התוצאות הפוטנציאליות המסייעות להבנת ההשפעות הווסקולריות והבסיס המכניסטי של פעולת הווזו-רלאקסנט של תמצית הצמח, כדלקמן.</…

Discussion

בכתב יד זה אנו מתארים את הטכניקה לבידוד של חולדות IPA ו- VSMCs. מספר פרוטוקולים ניסיוניים שימשו כדי לחקור את התגובה הווסקולרית של IPA במבחנה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לאפיין את האפקט הפרמקולוגי ואת הבסיס המכניסטי של IPA vasorelaxation המושרה על ידי תמצית צמחים.

בנוגע לפעולת מרחיב כלי ה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות למועצת המחקר הלאומית של תאילנד, למרכז המצוינות לחדשנות בכימיה (PERCH-CIC) ולרשת המחקר הבינלאומית (IRN61W0005) על מתן תמיכה כספית, ולמחלקה לפיזיולוגיה הפקולטה למדעי הרפואה, אוניברסיטת נארסואן, על תמיכה במתקני מחקר.

Materials

1,4-dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632
CAS NO. 348-12-3
4-aminopyridine (4-AP) Aldrich Chemical A78403
CAS NO. 504-24-5
Acetylcholine Sigma-Aldrich A6625
CAS NO. 60-31-1
Apamin Sigma-Aldrich A9459
CAS NO. 24345-16-2
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
CAS NO. 9048-46-8
Calcium choride Ajax Finechem AJA960
CAS NO. 1707055184
Charybdotoxin Sigma-Aldrich C7802
CAS NO. 95751-30-7
Collagenase type 1A Sigma-Aldrich C9891
CAS NO. 9001-12-1
From Clostridium histolyticum
D(+)-Glucose monohydrate Millipore Corporation K50876942 924
CAS NO. 14431-43-7
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540
CAS NO. 67-68-5
Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
CAS NO. 67-42-5
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884
CAS NO. 60-00-4
Forceps 11 cm. Rustless Dumoxel
Forceps 14 cm. Rustless Dumoxel
Glibenclamide Sigma-Aldrich G6039
CAS NO. 16673-34-0
GraphPad Prism program Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)
HEPES Sigma-Aldrich H3375
CAS NO. 7365-45-9
Iberiotoxin Sigma-Aldrich I5904
CAS NO. 1002546960
recombinant from Mesobuthus tamulus
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378
CAS NO. 53-86-1
Labchart Program Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).
Magnesium chloride Ajax Finechem 296
CAS NO. 1506254995
Male Wistar rats Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand
NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) Sigma-Aldrich N5751
CAS NO. 51298-62-5
Nicardipine Sigma-Aldrich N7510
CAS NO. 54527-84-3
Organ bath 15 mL. Specific order by the researchers
Papain Sigma-Aldrich P4762
CAS NO. 9001-73-4
FromPapaya Latex
Phenal red Sigma-Aldrich P5530
CAS NO. 34487-61-1
Phenylephrine Sigma-Aldrich P6126
CAS NO. 61-76-7
Potassium chloride Kemaus KA383
CAS NO. 7447-40-7
Potassium dihydrogenphosphate Aldrich Chemical EC231-913-4
CAS NO. 7778-77-0
S+A2:E36odium chloride Kemaus KA465
CAS NO. 7647-14-5
Scissors 11 cm. Spall Stainless
Scissors 14 cm. Spall Stainless
Sodium bicarbonate Ajax Finechem 475
CAS NO. 912466
Sodium dihydrogenphosphate Aldrich Chemical 33,198-8
CAS NO. 7558-80-7
Sodium hydroxide Ajax Finechem 482
CAS NO. 1506196602
Sodium thiopental Anesthal JPN3010002
CAS NO. 1C 314/47
Taurine Sigma-Aldrich T0625
CAS NO. 107-35-7
Waterbath WBU 45 Memmert 2766
CAS NO. –

References

  1. Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).
  2. Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. Nitric oxide and endothelial dysfunction. Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).
  3. Ruan, K. -. H. Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).
  4. Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review. Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).
  5. Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).
  6. Schmidt, K., de Wit, C. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
  7. Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle. Channels. 13 (1), 505-519 (2019).
  8. Wisutthathum, S., et al. Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).
  9. Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries. Molecules. 24 (12), 2243 (2019).
  10. Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature. British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).
  11. Paracha, T. U., et al. Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model. Molecules. 24 (2), 281 (2019).
  12. Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery. Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).
  13. Wisutthathum, S., et al. Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).
  14. Kruangtip, O., et al. Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).

Play Video

Cite This Article
To-on, K., Chatturong, U., Panklai, T., Palang, I., Inchan, A., Wisutthathum, S., Paracha, T. U., Apaikawee, P., Chootip, K. Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses. J. Vis. Exp. (184), e63686, doi:10.3791/63686 (2022).

View Video