Выделение внутрилегочной артерии и гладкомышечных клеток для исследования сосудистых реакций
Summary
Сосудистые реакции артериального легочного кровообращения могут быть изучены с использованием внутрилегочной артерии (IPA) и гладкомышечных клеток сосудов (VSMC). В настоящем исследовании подробно описывается изоляция IPA и протоколы, используемые для исследования вазорелаксации в ответ на физиологические стимулы.
Abstract
Внутрилегочная артерия (IPA) и сосудистые гладкомышечные клетки (VSMC), выделенные из легких крыс, могут быть использованы для изучения основных механизмов сужения сосудов и вазорелаксации. После выделения IPA и VSMC характеристики сосудистых реакций при физиологических и патологических состояниях могут быть оценены при отсутствии внешних факторов, таких как нервные сигналы, гормоны, цитокины и т.д. Таким образом, IPA и VSMC служат отличными моделями для изучения сосудистой физиологии / патофизиологии, наряду с различными экспериментальными исследованиями, такими как модуляция фармакологическими агентами, электрофизиологический анализ, визуализация кальция и т. Д. Здесь мы использовали технику выделения IPA для исследования сосудистых реакций в органной ванне. Сегменты IPA были установлены на камере ванны органа через внутрипросветные провода и стимулировались различными фармакологическими средствами. Изменения сосудистого тонуса IPA (т.е. вазоконстрикция и вазорелаксация) регистрировались с помощью изометрического преобразователя силы и программного обеспечения для анализа физиологических данных. Мы внедрили несколько экспериментальных протоколов, которые могут быть адаптированы для исследования механизмов вазорелаксации/вазоконстрикции для изучения фармакологической активности фитохимических или синтетических препаратов. Протоколы также могут быть использованы для оценки роли лекарств в модуляции различных заболеваний, включая легочную артериальную гипертензию. Модель IPA позволяет исследовать кривую концентрация-реакция, которая имеет решающее значение при оценке фармакодинамических параметров лекарственных средств.
Introduction
Легочная сосудистая система представляет собой сосудистую систему низкого давления, в которой основной функцией является доставка дезоксигенированной крови в газообменную область легких. Легочные артерии в легких расположены в ветвях параллельно бронхиальному дереву, в конечном итоге образуя обширную сеть капилляров, которая непрерывна над несколькими альвеолами и, наконец, собирается вместе в венулы и вены. Сосудистый тонус легочной артерии контролируется несколькими факторами, включая взаимодействие между эндотелием и гладкомышечными клетками сосудов (VSMC)1.
В этом исследовании мы фокусируемся на эндотелий-зависимой и -независимой вазорелаксации внутрилегочной артерии (IPA). Что касается эндотелий-зависимой вазорелаксации, различные механизмы, происходящие на поверхности эндотелиальных клеток, могут увеличивать внутриклеточную концентрацию Ca2+ (например, ацетилхолин [ACh] связывается с мускариновым рецептором [M3]), что приводит к образованию оксида азота (NO), простациклина (PGl2) и гиперполяризующего фактора, полученного из эндотелия (EDHF) (рисунок 1 ). NO является основным эндотелиевым расслабляющим фактором, синтезируемым из L-аргинина эндотелиальной синтазой оксида азота (eNOS)2, который затем диссоциирует из эндотелиальных клеток в VSMC (рисунок 1) и стимулирует растворимый фермент гуанилилциклазы (sGC); этот фермент превращает гуанозинтрифосфат (GTP) в циклический гуанозинмонофосфат (cGMP), который активирует протеинкиназу G (PKG) и снижает цитозольный уровень Ca2+, вызывая тем самым вазорелаксацию (рисунок 1). PGl2 синтезируется эндотелиальными клетками через циклооксигеназный (ЦОГ) путь 3,4. Он связывается с простациклиновым рецептором (IP) на VSMC и стимулирует фермент аденилилциклазу (AC), который затем превращает аденозинтрифосфат (АТФ) в циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) (Рисунок 1)3,4. цАМФ активирует протеинкиназу А (ПКА), снижая цитозольный уровень Ca2+ и вызывая вазорелаксацию5 (рисунок 1). Путь EDHF также участвует в эндотелий-зависимой вазорелаксации через различные эндотелиальные медиаторы и электрические события. Активация пути EDHF приводит к гиперполяризации VSMC, тем самым закрывая управляемые напряжением каналы Ca2+ (ЛОСК), снижая внутриклеточные уровни Ca2+ и индуцируя вазорелаксацию6. Эндотелий-независимое вазорелаксирование происходит непосредственно на VSMC с помощью нескольких механизмов, таких как снижение внутриклеточного уровня Ca2+, ингибирование миозин-тижной киназы (MLCK), активация миозин-фосфатазы легкой цепи (MLCP) и снижение чувствительности Ca2+ к сократительному механизму VSMC. В этом исследовании мы фокусируемся на вазорелаксации, вызванной открытием различных каналов K+, блокадой ЛОСЦ и ингибированием высвобождения Ca2+ из саркоплазматического ретикулума7, что приводит к снижению внутриклеточных уровней Ca2+, тем самым уменьшая фосфорилирование легкой цепи миозина VSMC и связывание миозина или образование поперечных мостов, соответственно, в конечном итоге приводит к вазорелаксации.
Методика оценки измерений вазоконстрикции и вазорелаксации в изолированных IPA хорошо зарекомендовала себя для грызунов, но данные варьировались в зависимости от экспериментальных протоколов. В настоящем исследовании описан метод, используемый для оценки сосудистой реактивности препаратов IPA для крыс in vitro, которые были сделаны в отсутствие внешних факторов, модулирующих сосудистый ответ in vivo, таких как нервные сигналы, гормоны, цитокины, артериальное давление и т. Д.
Мы использовали несколько экспериментальных протоколов, используя растительный экстракт в качестве примера для изучения сосудистой реактивности IPA. Различные блокаторы (рисунок 1) использовали для идентификации механизмов эндотелий-зависимого и -независимого вазорелаксирования, индуцированного растительным экстрактом. Тем не менее, те же протоколы могут быть адаптированы для оценки сосудистых реакций МПА на любые препараты, экстракты или фитохимические вещества, используемые для лечения различных легочных патологий.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи мы описываем технику выделения крыс iPA и VSMC. Несколько экспериментальных протоколов были использованы для исследования сосудистого ответа IPA in vitro, который может быть использован для характеристики фармакологического эффекта и механистической основы вазорелаксац…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Национальный исследовательский совет Таиланда, Центр передового опыта по инновациям в химии (PERCH-CIC) и Международную исследовательскую сеть (IRN61W0005) за предоставление финансовой поддержки, а также Факультет физиологии факультета медицинских наук Университета Наресуан за поддержку исследовательского центра.
Materials
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | – | – | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | – | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | – | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. – |
References
- Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).
- Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. Nitric oxide and endothelial dysfunction. Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).
- Ruan, K. -. H. Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).
- Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review. Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).
- Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).
- Schmidt, K., de Wit, C. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle. Channels. 13 (1), 505-519 (2019).
- Wisutthathum, S., et al. Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).
- Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries. Molecules. 24 (12), 2243 (2019).
- Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature. British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).
- Paracha, T. U., et al. Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model. Molecules. 24 (2), 281 (2019).
- Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery. Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).
- Wisutthathum, S., et al. Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).
- Kruangtip, O., et al. Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).
