Isolamento dell'arteria intrapolmonare e delle cellule muscolari lisce per studiare le risposte vascolari
Summary
Le risposte vascolari della circolazione polmonare arteriosa possono essere esplorate utilizzando l’arteria intrapolmonare (IPA) e le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC). Il presente studio descrive in dettaglio l’isolamento dell’IPA e i protocolli utilizzati per studiare la vasorilassazione in risposta a stimoli fisiologici.
Abstract
L’arteria intrapolmonare (IPA) e le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) isolate dai polmoni di ratto possono essere utilizzate per studiare i meccanismi sottostanti di vasocostrizione e vasorilassamento. Dopo aver isolato IPA e VSMC, le caratteristiche delle risposte vascolari in condizioni fisiologiche e patologiche possono essere valutate in assenza di fattori estrinseci come segnali nervosi, ormoni, citochine, ecc. Pertanto, l’IPA e i VSMC fungono da modelli eccellenti per lo studio della fisiologia / fisiopatologia vascolare, insieme a varie indagini sperimentali, come la modulazione da parte di agenti farmacologici, l’analisi elettrofisiologica patch-clamp, l’imaging del calcio, ecc. Qui, abbiamo usato una tecnica per isolare l’IPA per studiare le risposte vascolari in una configurazione di bagno d’organo. I segmenti di IPA sono stati montati sulla camera da bagno dell’organo tramite fili intraluminali e stimolati da vari agenti farmacologici. I cambiamenti nel tono vascolare IPA (cioè vasocostrizione e vasorilassamento), sono stati registrati utilizzando un trasduttore di forza isometrico e un programma software di analisi dei dati fisiologici. Abbiamo implementato diversi protocolli sperimentali, che possono essere adattati per studiare i meccanismi di vasorilassamento/vasocostrizione per lo studio delle attività farmacologiche di farmaci fitochimici o sintetici. I protocolli possono anche essere utilizzati per valutare il ruolo dei farmaci nella modulazione di varie malattie, tra cui l’ipertensione arteriosa polmonare. Il modello IPA ci permette di studiare la curva concentrazione-risposta, che è cruciale nella valutazione dei parametri farmacodinamici dei farmaci.
Introduction
La vascolarizzazione polmonare è un sistema vascolare a bassa pressione in cui la funzione principale è quella di fornire sangue deossigenato all’area di scambio di gas dei polmoni. Le arterie polmonari nei polmoni sono disposte in rami paralleli all’albero bronchiale, formando in definitiva una vasta rete di capillari che è continua su diversi alveoli e, infine, si uniscono in venule e vene. Il tono vascolare dell’arteria polmonare è controllato da diversi fattori, che coinvolgono l’interazione tra l’endotelio e le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC)1.
In questo studio, ci concentriamo sulla vasorilassazione endotelio-dipendente e indipendente dell’arteria intrapolmonare (IPA). Per quanto riguarda la vasorilassazione endotelio-dipendente, vari meccanismi che si verificano sulla superficie delle cellule endoteliali potrebbero aumentare la concentrazione intracellulare di Ca2+ (ad esempio, l’acetilcolina [ACh] si lega al recettore muscarinico [M3]), portando alla formazione di ossido nitrico (NO), prostaciclina (PGl2) e fattore iperpolarizzante derivato dall’endotelio (EDHF) (Figura 1 ). L’NO è il principale fattore rilassante derivato dall’endotelio sintetizzato dalla L-arginina mediante ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS)2, che poi si dissocia dalle cellule endoteliali ai VSMC (Figura 1) e stimola l’enzima solubile guanylyl cyclase (sGC); questo enzima trasforma la guanosina trifosfato (GTP) in guanosina monofosfato ciclico (cGMP), che attiva la protein chinasi G (PKG) e riduce i livelli citosolici di Ca2+, causando così vasorilassamento (Figura 1). PGl2 è sintetizzato dalle cellule endoteliali attraverso la via della ciclo-ossigenasi (COX) 3,4. Si lega con il recettore della prostaciclina (IP) sui VSMC e stimola l’enzima adenilil ciclasi (AC), che converte quindi l’adenosina trifosfato (ATP) in adenosina monofosfato ciclico (cAMP) (Figura 1)3,4. cAMP attiva la proteina chinasi A (PKA), riducendo i livelli citosolici di Ca2+ e causando vasorilassamento5 (Figura 1). La via EDHF partecipa anche alla vasorilassamento endotelio-dipendente attraverso vari mediatori endoteliali ed eventi elettrici. L’attivazione della via EDHF porta all’iperpolarizzazione dei VSMC, chiudendo così i canali Ca 2+ (COVC) azionati in tensione, riducendo i livelli intracellulari di Ca2+ e inducendo vasorilassamento6. La vasorilassazione endotelio-indipendente avviene direttamente sui VSMC attraverso diversi meccanismi, come la riduzione del livello intracellulare di Ca 2+, l’inibizione della miosina chinasi a catena leggera (MLCK), l’attivazione della fosfatasi della catena leggera della miosina (MLCP) e la riduzione della sensibilità di Ca2+ al macchinario contrattile delle VSMC. In questo studio, ci concentriamo sulla vasorilassamento causato dall’apertura di vari canali K+, il blocco dei COVC e l’inibizione del rilascio di Ca 2+ dal reticolo sarcoplasmatico7, che porta alla riduzione dei livelli intracellulari di Ca 2+, diminuendo così la fosforilazione della catena leggera della miosina VSMC e il legame miosina-actina o la formazione di ponti incrociati, rispettivamente, alla fine con conseguente vasorilassamento.
La tecnica per valutare le misure di vasocostrizione e vasorilassamento nell’IPA isolata è ben consolidata per i roditori, ma i dati variavano a seconda dei protocolli sperimentali. Il presente studio descrive il metodo utilizzato per valutare le reattività vascolari dei preparati IPA di ratto in vitro, che sono stati effettuati in assenza di fattori esterni che modulano la risposta vascolare in vivo, come segnali nervosi, ormoni, citochine, pressione sanguigna, ecc.
Abbiamo impiegato diversi protocolli sperimentali utilizzando l’estratto vegetale come esempio per studiare le reattività vascolari dell’IPA. Vari bloccanti (Figura 1) sono stati utilizzati per identificare i meccanismi di vasorilassamento endotelio-dipendente e indipendente indotto dall’estratto vegetale. Tuttavia, gli stessi protocolli possono essere adattati per valutare le risposte vascolari dell’IPA a qualsiasi farmaco, estratto o fitochimico utilizzato per il trattamento di varie patologie polmonari.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, descriviamo la tecnica per l’isolamento di IPA e VSMC di ratto. Diversi protocolli sperimentali sono stati impiegati per studiare la risposta vascolare dell’IPA in vitro, che possono essere utilizzati per caratterizzare l’effetto farmacologico e le basi meccanicistiche della vasorilassazione dell’IPA indotta dall’estratto vegetale.
Per quanto riguarda l’azione vasodilatatrice endotelio-dipendente dell’estratto vegetale, sono stati impiegati vari bloccanti come L…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Consiglio Nazionale delle Ricerche della Thailandia, il Centro di eccellenza per l’innovazione in chimica (PERCH-CIC) e la Rete internazionale di ricerca (IRN61W0005) per aver fornito supporto finanziario e il Dipartimento di Fisiologia della Facoltà di Scienze Mediche, Naresuan University, per il supporto delle strutture di ricerca.
Materials
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
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| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
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| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
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| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
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| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
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| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
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| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
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| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
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| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
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| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
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| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
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| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
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| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
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| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
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| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
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| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
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| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
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| Organ bath 15 mL. | – | – | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
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| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
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| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
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| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
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| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
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| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | – | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | – | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
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| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
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| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
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| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
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| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
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| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. – |
References
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