Isolierung von intrapulmonalen Arterien- und glatten Muskelzellen zur Untersuchung von Gefäßreaktionen
Summary
Vaskuläre Reaktionen des arteriellen Lungenkreislaufs können mit Hilfe von intrapulmonalen Arterien (IPA) und vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) erforscht werden. Die vorliegende Studie beschreibt detailliert die Isolierung von IPA und die Protokolle, die zur Untersuchung der Vasorelaxation als Reaktion auf physiologische Reize verwendet werden.
Abstract
Die intrapulmonale Arterie (IPA) und die vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs), die aus Rattenlungen isoliert wurden, können verwendet werden, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Vasokonstriktion und Vasorelaxation zu untersuchen. Nach der Isolierung der IPA- und VSMCs können die Eigenschaften der vaskulären Reaktionen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen in Abwesenheit extrinsischer Faktoren wie Nervensignale, Hormone, Zytokine usw. beurteilt werden. Daher dienen die IPA und VSMCs als hervorragende Modelle für die Untersuchung der vaskulären Physiologie / Pathophysiologie, zusammen mit verschiedenen experimentellen Untersuchungen, wie Modulation durch pharmakologische Wirkstoffe, Patch-Clamp-elektrophysiologische Analyse, Kalziumbildgebung usw. Hier haben wir eine Technik zur Isolierung des IPA verwendet, um vaskuläre Reaktionen in einem Organbadaufbau zu untersuchen. IPA-Segmente wurden über intraluminale Drähte auf die Organbadkammer montiert und durch verschiedene pharmakologische Wirkstoffe stimuliert. Die Veränderungen des IPA-Gefäßtonus (d.h. Vasokonstriktion und Vasorelaxation) wurden mit einem isometrischen Kraftaufnehmer und einer physiologischen Datenanalysesoftware aufgezeichnet. Wir implementierten mehrere experimentelle Protokolle, die angepasst werden können, um die Mechanismen der Vasorelaxation / Vasokonstriktion zur Untersuchung der pharmakologischen Aktivitäten von phytochemischen oder synthetischen Arzneimitteln zu untersuchen. Die Protokolle können auch verwendet werden, um die Rolle von Medikamenten bei der Modulation verschiedener Krankheiten, einschließlich pulmonaler arterieller Hypertonie, zu bewerten. Das IPA-Modell ermöglicht es uns, die Konzentrations-Wirkungs-Kurve zu untersuchen, die für die Bewertung der pharmakodynamischen Parameter von Arzneimitteln entscheidend ist.
Introduction
Das Lungengefäßsystem ist ein Niederdruck-Gefäßsystem, in dem die Hauptfunktion darin besteht, sauerstoffarmes Blut in den gasaustauschenden Bereich der Lunge zu liefern. Die Lungenarterien in der Lunge sind in Ästen parallel zum Bronchialbaum angeordnet und bilden schließlich ein ausgedehntes Netzwerk von Kapillaren, das sich über mehrere Alveolen erstreckt und schließlich zu Venolen und Venen zusammenführt. Der Gefäßtonus der Lungenarterie wird durch mehrere Faktoren gesteuert, die die Interaktion zwischen dem Endothel und den vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) beinhalten1.
In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die endothelabhängige und -unabhängige Vasorelaxation der intrapulmonalen Arterie (IPA). Im Hinblick auf die endothelabhängige Vasorelaxation könnten verschiedene Mechanismen, die auf der Oberfläche von Endothelzellen auftreten, die intrazelluläre Ca2+-Konzentration erhöhen (z.B. bindet Acetylcholin [ACh] an Muskarinrezeptor [M3]), was zur Bildung von Stickstoffmonoxid (NO), Prostacyclin (PGl2) und Endothel-abgeleitetem Hyperpolarisationsfaktor (EDHF) führt (Abbildung 1 ). NO ist der wichtigste Endothel-abgeleitete Entspannungsfaktor, der aus L-Arginin durch endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS)2 synthetisiert wird, die dann aus den Endothelzellen zu VSMCs dissoziiert (Abbildung 1) und das Enzym lösliche Guanylylzyklase (sGC) stimuliert; Dieses Enzym wandelt Guanosintriphosphat (GTP) in zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) um, das die Proteinkinase G (PKG) aktiviert und den zytosolischen Ca2+-Spiegel senkt, wodurch eine Vasorelaxation verursacht wird (Abbildung 1). PGl2 wird von Endothelzellen über den Cyclooxygenase (COX) -Weg 3,4 synthetisiert. Es bindet an den Prostacyclinrezeptor (IP) auf VSMCs und stimuliert das Enzym Adenylylzyklase (AC), das dann Adenosintriphosphat (ATP) in zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) umwandelt (Abbildung 1)3,4. cAMP aktiviert die Proteinkinase A (PKA), senkt den zytosolischen Ca2+-Spiegel und verursacht Vasorelaxation5 (Abbildung 1). Der EDHF-Signalweg ist auch an der endothelabhängigen Vasorelaxation über verschiedene endotheliale Mediatoren und elektrische Ereignisse beteiligt. Die Aktivierung des EDHF-Signalwegs führt zur Hyperpolarisation von VSMCs, wodurch spannungsbetriebene Ca 2+ Kanäle (VOCCs) geschlossen, intrazelluläre Ca2+ Spiegel reduziert und Vasorelaxation induziertwerden 6. Die endothelunabhängige Vasorelaxation erfolgt direkt an VSMCs über mehrere Mechanismen, wie die Reduktion des intrazellulären Ca 2+ Spiegels, die Hemmung der Myosin Light Chain Kinase (MLCK), die Aktivierung der Myosin Light Chain Phosphatase (MLCP) und die Reduktion der Ca2+ Sensitivität gegenüber der kontraktilen Maschinerie von VSMCs. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die Vasorelaxation, die durch die Öffnung verschiedener K+-Kanäle, die Blockade von VOCCs und die Hemmung der Ca 2+-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum7 verursacht wird, was zur Senkung der intrazellulären Ca 2+-Spiegel führt, wodurch die VSMC-Myosin-Leichtkettenphosphorylierung bzw. die Myosin-Aktin-Bindung bzw. Querbrückenbildung verringert wird. letztendlich zu Vasorelaxation führen.
Die Technik zur Auswertung von Vasokonstriktions- und Vasorelaxationsmessungen in isoliertem IPA ist für Nagetiere gut etabliert, aber die Daten variierten je nach den experimentellen Protokollen. Die vorliegende Studie beschreibt die Methode zur Bewertung der vaskulären Reaktivitäten von IPA-Präparaten der Ratte in vitro, die in Abwesenheit externer Faktoren, die die vaskuläre Reaktion in vivo modulieren, wie Nervensignale, Hormone, Zytokine, Blutdruck usw., durchgeführt wurden.
Wir verwendeten mehrere experimentelle Protokolle mit dem Pflanzenextrakt als Beispiel für die Untersuchung der vaskulären Reaktivitäten von IPA. Verschiedene Blocker (Abbildung 1) wurden verwendet, um die Mechanismen der endothelabhängigen und -unabhängigen Vasorelaxation zu identifizieren, die durch den Pflanzenextrakt induziert werden. Dennoch können die gleichen Protokolle angepasst werden, um die vaskulären Reaktionen von IPA auf Medikamente, Extrakte oder sekundäre Pflanzenstoffe zu bewerten, die zur Behandlung verschiedener Lungenpathologien verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Manuskript beschreiben wir die Technik zur Isolierung von Ratten-IPA und VSMCs. Mehrere experimentelle Protokolle wurden verwendet, um die vaskuläre Reaktion von IPA in vitro zu untersuchen, die verwendet werden kann, um die pharmakologische Wirkung und mechanistische Grundlage der durch Pflanzenextrakt induzierten IPA-Vasorelaxation zu charakterisieren.
Hinsichtlich der endothelabhängigen gefäßerweiternden Wirkung des Pflanzenextrakts wurden verschiedene Blocker wie L-N…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem National Research Council of Thailand, dem Center of Excellence for Innovation in Chemistry (PERCH-CIC) und dem International Research Network (IRN61W0005) für die finanzielle Unterstützung sowie dem Department of Physiology Faculty of Medical Science der Naresuan University für die Unterstützung von Forschungseinrichtungen.
Materials
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
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| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
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| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
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| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
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| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
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| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
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| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
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| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
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| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
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| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
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| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
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| Organ bath 15 mL. | – | – | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
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| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | – | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | – | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. – |
References
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