Protokoll zur Entwicklung eines Femurosteotomiemodells bei Wistar Albino-Ratten

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um den Femurschaft von Wistar-Albinoratten iatrogen zu brechen und die Entwicklung des Kallus zu verfolgen. Dieses Femurosteotomiemodell kann Forschern helfen, den Prozess der Frakturheilung zu bewerten und zu untersuchen, wie ein Medikament die Frakturheilung beeinflussen könnte.

Abstract

Frakturheilung ist ein physiologischer Prozess, der zur Regeneration von Knochendefekten durch die koordinierte Wirkung von Osteoblasten und Osteoklasten führt. Osteoanabole Medikamente haben das Potenzial, die Reparatur von Frakturen zu verbessern, haben aber Einschränkungen wie hohe Kosten oder unerwünschte Nebenwirkungen. Das Knochenheilungspotenzial eines Medikaments kann zunächst durch In-vitro-Studien bestimmt werden, für den endgültigen Machbarkeitsnachweis sind jedoch In-vivo-Studien erforderlich. Unser Ziel war es, ein Femurosteotomie-Nagetiermodell zu entwickeln, das Forschern helfen könnte, die Entwicklung der Kallusbildung nach einer Fraktur des Femurschaftes zu verstehen und festzustellen, ob ein potenzielles Medikament knochenheilende Eigenschaften hat. Erwachsene männliche Wistar-Albinoratten wurden nach Freigabe durch das Institutional Animal Ethics Committee verwendet. Die Nagetiere wurden betäubt, und unter aseptischen Bedingungen wurden vollständige Querfrakturen am mittleren Drittel der Oberschenkelknochenschaft mittels offener Osteotomie erzeugt. Die Frakturen wurden reduziert und innerlich mit intramedullären K-Drähten fixiert, und die sekundäre Frakturheilung konnte stattfinden. Nach der Operation wurden intraperitoneale Analgetika und Antibiotika für 5 Tage verabreicht. Sequentielle wöchentliche Röntgenaufnahmen beurteilten die Kallusbildung. Die Ratten wurden basierend auf radiologisch vorgegebenen Zeitpunkten geopfert, und die Entwicklung des Frakturkallus wurde radiologisch und immunhistochemisch analysiert.

Introduction

Knochen ist ein dichtes Bindegewebe, das aus knochenbildenden Zellen, den Osteoblasten, und knochenresorbierenden Zellen, den Osteoklasten, besteht. Frakturheilung ist ein physiologischer Prozess, der zur Regeneration von Knochendefekten durch die koordinierte Wirkung von Osteoblasten und Osteoklasten führt¹. Bei einer Fraktur sind osteoblastische und osteoklastische Aktivität an der Frakturstelle einige der wichtigen Faktoren, die die Knochenheilung bestimmen². Wenn die Frakturheilung von ihrem normalen Verlauf abweicht, führt dies zu einer verzögerten Vereinigung, Malunion oder Nichtvereinigung. Eine Fraktur wird als nicht vereint bezeichnet, wenn die Vereinigung der Fraktur für 9 Monate fehlschlägt, ohne dass die Reparatur in den letzten 3 Monaten fortschreitet³. Bei etwa 10%-15% aller Frakturen kommt es zu einer Verzögerung der Reparatur, die zu einer Nichtvereinigung führen kann⁴. Die Nichtvereinigungsrate für alle Frakturen beträgt 5% -10% und variiert je nach Knochen und Frakturstelle⁵.

Das derzeitige Regime für die Behandlung der Nichtvereinigung von Frakturen umfasst chirurgische und / oder medizinische Modalitäten. Derzeit können verzögerte oder fehlende Frakturen durch chirurgische Strategien wie Knochentransplantation überwunden werden. Die Knochentransplantation hat jedoch ihre Einschränkungen und Komplikationen wie die Verfügbarkeit von Transplantatgewebe, Schmerzen an der Spenderstelle, Morbidität und Infektion⁶. Die medizinische Behandlung umfasst osteoanabole Medikamente wie Knochenmorphogenetisches Protein (BMP) und Teriparatid (Parathormonanalogon). Derzeit verwendete osteoanabole Mittel haben das Potenzial, die Reparatur von Frakturen zu verstärken, haben jedoch Einschränkungen wie exorbitante Kosten oder unerwünschte Nebenwirkungen⁷. Daher besteht Spielraum für die Identifizierung kostengünstiger, nicht-chirurgischer Alternativen für die Knochenheilung. Das Knochenheilungspotenzial eines Medikaments kann zunächst durch In-vitro-Studien bestimmt werden, für den endgültigen Machbarkeitsnachweis sind jedoch In-vivo-Studien erforderlich. Ein Medikament, von dem bekannt ist, dass es die Knochenheilung verbessert, sollte in vitro bewertet werden und, wenn es sich als vielversprechend erweist, für In-vivo-Tiermodellstudien verwendet werden. Wenn sich herausstellt, dass das Medikament die Knochenbildung und den Umbau im In-vivo-Modell fördert, könnte es zur nächsten Stufe (d. H. Klinische Studien) übergehen.

Die Beurteilung der Frakturheilung bei Tieren ist ein logischer Schritt nach vorne, um einen neuartigen Wirkstoff zu bewerten, der für die Knochenheilung eingeführt wurde, bevor er am Menschen getestet wird. Für in vivo Tiermodellstudien zur Frakturheilung sind Nagetiere zu einem immer beliebteren Modell⁸ geworden. Die Nagetiermodelle haben aufgrund der niedrigen Betriebskosten, des begrenzten Platzbedarfs und der geringeren Zeit für die Knochenheilung zunehmendes Interesse geweckt⁹. Darüber hinaus verfügen Nagetiere über ein breites Spektrum an Antikörpern und Gentargets, die Untersuchungen zu den molekularen Mechanismen der Knochenheilung und -regeneration ermöglichen¹⁰. Eine Konsensussitzung hob verschiedene Knochenheilungsmodelle für Kleintiere umfassend hervor und konzentrierte sich auf die verschiedenen Parameter, die die Knochenheilung beeinflussen, sowie mehrere Kleintierfrakturmodelle und Implantate¹¹.

Grundlegende Bruchmodelle können grob in offene oder geschlossene Modelle unterteilt werden. Geschlossene Frakturmodelle verwenden eine Drei- oder Vierpunktbiegekraft auf den Knochen und erfordern keinen konventionellen chirurgischen Ansatz. Sie führen zu schrägen oder spiralförmigen Frakturen, die langen Knochenbrüchen beim Menschen ähneln, aber die fehlende Standardisierung von Frakturort und -dimensionen kann bei ihnen als Störfaktor wirken¹². Offene Frakturmodelle erfordern einen chirurgischen Zugang für die Osteotomie des Knochens, helfen, ein konsistenteres Frakturmuster an der Frakturstelle zu erreichen, sind aber im Vergleich zu den geschlossenen Modellen mit einer verzögerten Heilung verbunden¹³. Die Wahl des Knochens, der zur Untersuchung der Frakturheilung verwendet wird, bleibt aufgrund ihrer Abmessungen und Zugänglichkeit hauptsächlich die Tibia und der Femur. Die Wahl der Frakturstelle ist in der Regel die Diaphyse oder Metaphyse. Die metaphysäre Region wird speziell in Fällen gewählt, in denen die Frakturheilung bei osteoporotischen Probanden untersucht wird, da die Metaphyse stärker von Osteoporose betroffen ist¹⁴. Mehrere Implantate wie Markstifte und externe Fixateure können zur Stabilisierung der Fraktur^11,15 verwendet werden.

Das Ziel dieser Studie war es, ein einfaches und leicht verständliches Nagetiermodell zu entwickeln, das Forschern helfen könnte, nicht nur die Entwicklung des Kallus nach einer Femurfraktur zu verstehen, sondern auch zu bestimmen, ob ein potenzielles Medikament knochenheilende Eigenschaften hat, indem es den Mechanismus versteht, durch den es wirkt.

Protocol

Tierversuche wurden nach ethischer Genehmigung des Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), AIIMS, Neu-Delhi, Indien (286/IAEC-1/2021) durchgeführt. 1. Präoperatives Verfahren Männliche Wistar-Albinoratten im Alter von 6 bis 8 Wochen mit einem Gewicht zwischen 150 und 200 g in einer zentralen Tiereinrichtung (CAF) in separaten Einzelkäfigen. Dies stellt sicher, dass keine chirurgische / Frakturstelle verletzt wird, wenn sich mehrere Ratten Käfige teilen.</l…

Representative Results

Diese Studie wurde durchgeführt, um ein Femurosteotomiemodell bei Wistar-Albinoratten zu entwickeln. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Knochenheilung sowie die osteogene Wirkung eines vielversprechenden osteoanabolen Medikaments bei der Knochenheilung zu bewerten. Die üblichen chirurgischen Vorsichtsmaßnahmen und Protokolle wurden befolgt. Für den Eingriff wurden sterile Kittel, Abdecktücher und chirurgische Geräte verwendet (Abbildung 1). Das Gerät (Tabelle 1</stron…

Discussion

Diese Methode beschreibt klar die Details, die für die Entwicklung eines Frakturosteotomiemodells bei Wistar-Albinoratten erforderlich sind. Dieses Modell kann verwendet werden, um die osteogene Wirkung eines vielversprechenden osteoanabolen Medikaments bei der Frakturheilung zu bewerten und die Feinheiten der Knochenheilung zu verstehen. Das hervorstechende Merkmal dieser Methode ist, dass sie einfach ist und nicht zu viel Zeit oder anspruchsvolle Ausrüstung benötigt. Bei dieser Methode wurden erwachsene männliche W…

Materials

Alcohol	Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	MFG/MD/2019/000189	Sterillium hand disinfectant
Artery forceps	Nebula surgical, Gujarat, India	G.105.05S	5", straight
Bard-Parker handle	Nebula surgical, Gujarat, India	G.103.03	Size number 3
Betadine solution	Win-medicare New Delhi, India	UP14250000001	10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor	Nebula surgical, Gujarat, India	908.S	Small
EDTA	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	43272	Disodium salt
Eosin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	115935	For preparing the staining solution
Forceps (plain)	Nebula surgical, Gujarat, India	115.06	6", plain
Forceps (toothed)	Nebula surgical, Gujarat, India	117.06	6", toothed
Formaldehyde	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	84439	For preparing the neutral buffered formalin
Haematoxylin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	104302	For preparing the staining solution
Hammer	Nebula surgical, Gujarat, India	401.M
Injection Cefuroxime	Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India	48/UA/SC/P-2013	Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial
Injection Ketamine	Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India	G/28-B/6	Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL
Injection Xylazine	Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India	28/RR/AP/2009/F/G	Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine	Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India	1308-B	2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol	Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India	MB/07/500	Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire	Nebula surgical, Gujarat, India	166 (1mm)	12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire	‎Bosch, Germany	06019F70K4	GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.121.06S	6", straight
Needle holder	Nebula surgical, Gujarat, India	G.108.06	6", straight
Ophthalmic ointment	GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India	KTK/28a/467/2001	Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel)	Nebula surgical, Gujarat, India	1001.S.10	10 mm, straight
Periosteal elevator	Nebula surgical, Gujarat, India	918.10.S	10 mm, straight
Pliers cum wire cutter	Nebula surgical, Gujarat, India	604.65
Reynold’s scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.110.06S	6", straight
Standard semi-synthetic diet	Ashirvad Industries, Chandigarh, India	No catalog number available	Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application	Local purchase	No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments	Local purchase	No catalog number available
Sterile gauze	Ideal Healthcare Industries, Delhi, India	E(0047)/14/MNB/7951	Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support	Local purchase	No catalog number available	Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 303060	1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 307749	2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India	334-B(H)	10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15115E	Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15124E	Sterile, Single use
Sutures	Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India	SN 3318	4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture
Wax block in aluminium tray	Locally fabricated	No catalog number available	30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine	Philips India Ltd, Gurugram, Haryana	SN19861013	Model: Philips Digital Diagnost R 4.2