In situ Hibridación combinada con inmunohistoquímica en embriones crioseccionados de pez cebra
Summary
Este protocolo describe cómo obtener imágenes combinando hibridación in situ e inmunohistoquímica de secciones embrionarias de pez cebra. La hibridación in situ se realizó antes de la criosección, seguida de tinción de anticuerpos. Es útil detectar los patrones de expresión de dos genes en el pez cebra si hay escasez de anticuerpos.
Abstract
Como vertebrado, el pez cebra ha sido ampliamente utilizado en estudios biológicos. El pez cebra y los humanos comparten una alta homología genética, lo que permite su uso como modelo para enfermedades humanas. El estudio de la función génica se basa en la detección de patrones de expresión génica. Aunque la inmunohistoquímica ofrece una forma poderosa de evaluar la expresión de proteínas, el número limitado de anticuerpos disponibles comercialmente en el pez cebra restringe la aplicación de costaining. La hibridación in situ es ampliamente utilizada en embriones de pez cebra para detectar la expresión de ARNm. Este protocolo describe cómo obtener imágenes combinando hibridación in situ e inmunohistoquímica para secciones de embriones de pez cebra. La hibridación in situ se realizó antes de la criosección, seguida de tinción de anticuerpos. La inmunohistoquímica y la imagen de una sola criosección se realizaron después de la hibridación in situ . El protocolo es útil para desentrañar el patrón de expresión de dos genes, primero mediante la detección de transcripción in situ y luego mediante inmunohistoquímica contra una proteína en la misma sección.
Introduction
El pez cebra es un poderoso modelo vertebrado para estudios de desarrollo y genética 1,2. El pez cebra y los humanos comparten una alta homología genética (el 70% de los genes son compartidos con el genoma humano), lo que permite su uso como modelo para enfermedades humanas3. En el pez cebra, es bastante común detectar los patrones de expresión de dos genes y su relación espacial. La inmunohistoquímica se utilizó por primera vez en 1941 para detectar patógenos en tejidos infectados mediante la aplicación de anticuerpos marcados con FITC4. La proteína diana en la sección de tejido se marca primero con un anticuerpo primario, y la sección se marca con un anticuerpo secundario contra la inmunoglobulina de la especie huésped del anticuerpo primario. La tinción de anticuerpos es un enfoque robusto para detectar la localización de proteínas, que ofrece una alta resolución óptica a nivel intracelular. Sin embargo, el número de anticuerpos disponibles es muy limitado en el pez cebra. Un estudio reciente muestra que aproximadamente 112,000 anticuerpos están disponibles comercialmente para ratones; Sin embargo, se ha demostrado que muy pocos anticuerpos son confiables en el pez cebra5.
En cambio, en el pez cebra, la hibridación in situ se ha aplicado ampliamente para el análisis de patrones de expresión génica. Este método se utilizó por primera vez para evaluar la expresión génica en embriones de Drosophila en la década de 19806,7, y desde entonces, esta tecnología se ha desarrollado y mejorado continuamente. Inicialmente, se utilizaron sondas de ADN radiomarcadas para detectar transcripciones de ARNm; Sin embargo, la resolución espacial era relativamente baja y había riesgos potenciales para la salud causados por la radiactividad. Posteriormente, la hibridación in situ se basa en las sondas de ARN marcadas con digoxigenina (DIG) o fluoresceína (Fluo), que se conjugan con fosfatasa alcalina (AP) o se detectan mediante amplificación de señal de tiramida fluorescente (TSA)8,9. Aunque TSA se ha utilizado para detectar dos o tres genes, el marcado DIG de sondas de ARN y el anticuerpo conjugado antiDIG AP siguen siendo enfoques altamente sensibles, estables y ampliamente utilizados para la hibridación in situ. Por lo tanto, los anticuerpos comercializados combinados con sondas in situ marcadas con DIG son útiles para proporcionar información sobre la localización de proteínas y la expresión de un gen.
Los embriones de montaje entero no pueden revelar la relación espacial entre los genes debido a la baja resolución óptica, a pesar de que los embriones de pez cebra son pequeños y transparentes10. Por lo tanto, la sección es necesaria para analizar los patrones de expresión de los genes a nivel intracelular. La criosección ha sido ampliamente utilizada en el pez cebra, ya que es fácil de realizar y puede preservar eficazmente el antígeno. Por lo tanto, la hibridación in situ combinada con inmunohistoquímica en criosecciones de pez cebra ofrece una forma poderosa de analizar los patrones de expresión de dos genes. Se ha aplicado una combinación de hibridación in situ e inmunohistoquímica al pez cebra11. Sin embargo, el tratamiento con proteinasa K se utilizó para mejorar la penetración de la sonda a expensas de la integridad del antígeno. Para superar esta limitación, este protocolo utiliza el calentamiento para inducir la recuperación de antígenos. Este protocolo no solo es aplicable a embriones de diferentes estadios y secciones de tejido de diversos grosores (secciones de cabeza de 14 μm y secciones de médula espinal de 20 μm), sino que también se ha verificado mediante el uso de genes expresados en dos órganos, incluyendo la cabeza y la médula espinal.
Este artículo describirá cómo combinar la hibridación in situ y la tinción de anticuerpos en embriones de pez cebra en criosecciones. La versatilidad de este protocolo se demuestra mediante el uso de una serie de combinaciones de hibridación-inmunohistoquímica in situ, incluidas las sondas de hibridación in situ para dos neuronas diferentes. Este método es adecuado para detectar ARNm y proteínas en diferentes regiones y embriones de diferentes edades, así como los patrones de expresión de dos genes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo propone una combinación de hibridación in situ e inmunohistoquímica, un paso importante en los experimentos de colocalización en embriones de pez cebra. Este método sirve como una forma fácil y eficiente de analizar simultáneamente un ARNm y una proteína. La hibridación in situ y la tinción de anticuerpos se realizaron en embriones de pez cebra. En contraste con varios protocolos publicados anteriormente14,15,16,<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencia y Tecnología de Nantong de China (MS12019011), la Fundación de Ciencia y Tecnología de Nantong de China (JC2021058) y la Fundación de Ciencias Naturales de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (21KJB180009).
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
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