Summary

In situ Hybridation combinée à l’immunohistochimie dans des embryons de poisson-zèbre cryosectionnés

Published: March 03, 2022
doi:

Summary

Ce protocole décrit comment obtenir des images en combinant l’hybridation in situ et l’immunohistochimie de coupes embryonnaires de poisson-zèbre. L’hybridation in situ a été réalisée avant la cryosection, suivie d’une coloration des anticorps. Il est utile de détecter les schémas d’expression de deux gènes chez le poisson zèbre s’il y a une pénurie d’anticorps.

Abstract

En tant que vertébré, le poisson zèbre a été largement utilisé dans les études biologiques. Le poisson zèbre et les humains partagent une homologie génétique élevée, ce qui permet son utilisation comme modèle pour les maladies humaines. L’étude de la fonction génique est basée sur la détection des profils d’expression génique. Bien que l’immunohistochimie offre un moyen puissant de tester l’expression des protéines, le nombre limité d’anticorps disponibles dans le commerce chez le poisson zèbre limite l’application de costaining. L’hybridation in situ est largement utilisée dans les embryons de poisson zèbre pour détecter l’expression de l’ARNm. Ce protocole décrit comment obtenir des images en combinant l’hybridation in situ et l’immunohistochimie pour les coupes d’embryons de poisson zèbre. L’hybridation in situ a été réalisée avant la cryosection, suivie d’une coloration des anticorps. L’immunohistochimie et l’imagerie d’une seule cryosection ont été réalisées après hybridation in situ . Le protocole est utile pour démêler le schéma d’expression de deux gènes, d’abord par détection de transcrits in situ , puis par immunohistochimie contre une protéine dans la même section.

Introduction

Le poisson-zèbre est un puissant modèle vertébré pour les études de développement et de génétique 1,2. Le poisson-zèbre et l’homme partagent une homologie génétique élevée (70% des gènes sont partagés avec le génome humain), ce qui permet son utilisation comme modèle pour les maladies humaines3. Chez le poisson zèbre, il est assez courant de détecter les schémas d’expression de deux gènes et leur relation spatiale. L’immunohistochimie a été utilisée pour la première fois en 1941 pour détecter les agents pathogènes dans les tissus infectés en appliquant des anticorps marqués FITC4. La protéine cible dans la section tissulaire est d’abord marquée avec un anticorps primaire, puis la section est marquée avec un anticorps secondaire contre l’immunoglobuline de l’espèce hôte de l’anticorps primaire. La coloration par anticorps est une approche robuste pour détecter la localisation des protéines, qui offre une résolution optique élevée au niveau intracellulaire. Cependant, le nombre d’anticorps disponibles est très limité chez le poisson zèbre. Une étude récente montre qu’environ 112 000 anticorps sont disponibles dans le commerce pour les souris; Cependant, très peu d’anticorps se sont révélés fiables chez le poisson zèbre5.

Au lieu de cela, chez le poisson zèbre, l’hybridation in situ a été largement appliquée pour l’analyse du modèle d’expression génique. Cette méthode a été utilisée pour la première fois pour évaluer l’expression génique dans les embryons de drosophile dans les années 19806,7, et depuis lors, cette technologie a été continuellement développée et améliorée. Initialement, des sondes ADN radiomarquées ont été utilisées pour détecter les transcrits d’ARNm; Cependant, la résolution spatiale était relativement faible et la radioactivité présentait des risques potentiels pour la santé. Par la suite, l’hybridation in situ repose sur les sondes à ARN marquées à la digoxigénine (DIG) ou à la fluorescéine (Fluo), qui sont conjuguées à la phosphatase alcaline (AP) ou détectées par amplification fluorescente du signal tyramide (TSA)8,9. Bien que la TSA ait été utilisée pour détecter deux ou trois gènes, le marquage DIG des sondes à ARN et des anticorps conjugués antiDIG AP sont encore des approches très sensibles, stables et largement utilisées pour l’hybridation in situ. Par conséquent, les anticorps commercialisés combinés à des sondes in situ marquées par DIG sont utiles pour fournir un aperçu de la localisation et de l’expression des protéines d’un gène.

Les embryons entiers ne peuvent pas révéler la relation spatiale entre les gènes en raison de la faible résolution optique, même si les embryons de poisson zèbre sont petits et transparents10. Par conséquent, la sectionnement est nécessaire pour analyser les modèles d’expression des gènes au niveau intracellulaire. La cryosectionnement a été largement utilisée chez le poisson zèbre car elle est facile à réaliser et peut préserver efficacement l’antigène. Par conséquent, l’hybridation in situ combinée à l’immunohistochimie dans les cryosections de poisson zèbre offre un moyen puissant d’analyser les schémas d’expression de deux gènes. Une combinaison d’hybridation in situ et d’immunohistochimie a été appliquée au poisson zèbre11. Cependant, le traitement par protéinase K a été utilisé pour améliorer la pénétration de la sonde au détriment de l’intégrité de l’antigène. Pour surmonter cette limitation, ce protocole utilise le chauffage pour induire la récupération de l’antigène. Ce protocole est non seulement applicable aux embryons de différents stades et aux coupes tissulaires de différentes épaisseurs (coupes de tête de 14 μm et coupes de moelle épinière de 20 μm), mais il a également été vérifié en utilisant des gènes exprimés dans deux organes, dont la tête et la moelle épinière.

Cet article décrira comment combiner l’hybridation in situ et la coloration d’anticorps dans des embryons de poisson zèbre dans des cryosections. La polyvalence de ce protocole est démontrée par l’utilisation d’un certain nombre de combinaisons hybridation-immunohistochimie in situ, y compris des sondes d’hybridation in situ pour deux neurones différents. Cette méthode convient à la détection de l’ARNm et des protéines dans différentes régions et embryons d’âges différents, ainsi que des schémas d’expression de deux gènes.

Protocol

Tous les protocoles sur les animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Nantong (n ° S20191210-402). 1. Collecte d’embryons de poisson zèbre Installez une paire de poissons-zèbres dans des bassins d’élevage la veille de la collecte des œufs, l’un étant un poisson zèbre transgénique et l’autre un poisson zèbre de type sauvage AB (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB de type sauv…

Representative Results

Ce protocole peut être utilisé pour examiner simultanément le modèle d’expression d’un ARNm et d’une protéine. La figure 1 illustre le flux de travail expérimental. Le récepteur 5-HT2C est un sous-type du récepteur 5-HT lié par le neurotransmetteur sérotonine (5-hydroxytryptamine, 5-HT). Il est largement distribué dans le système nerveux central (SNC) et peut réguler de manière significative une variété de fonctions cérébrales, y compris l’appétit, l’humeur, l’…

Discussion

Ce protocole propose une combinaison d’hybridation in situ et d’immunohistochimie, une étape importante dans les expériences de colocalisation sur des embryons de poisson zèbre. Cette méthode constitue un moyen simple et efficace d’analyser simultanément un ARNm et une protéine. L’hybridation in situ et la coloration des anticorps ont été effectuées sur des embryons de poisson zèbre. Contrairement à plusieurs protocoles publiés précédemment14,15,16<sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), la Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) et la Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).

Materials

Alexa Fluor 488 secondary antibody Invitrogen A21202
Anti-Digoxigenin AP Fab fragments Roche 11093274910
Anti-GFP antibody Millipore MAB3580
Blocking solution made in lab N/A 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS
BM purple Roche 11442074001
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma B2064
CaCl2 Sigma C5670
Citrate buffer Leagene IH0305
Citric acid Sigma C2404
Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm Head Biotechnology H4566
DEPC-Treated Water Sangon Biotech B501005
Digital camera, fluorescence microscope Nikon NI-SSR 931479
E3 embryo medium made in lab N/A 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Formamide Invitrogen AM9342
Goat serum Sigma G9023
Heparin sodium salt J&K Scientific 542858
HYB made in lab N/A preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt
Immunohistochemical wet box Mkbio MH10002
KCl Sigma P5405
Low profile leica blades Leica 819
MABT (1x) made in lab N/A 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5
Maleic acid Sigma M0375
Methanol J&K Scientific 116481
Methylene blue Macklin M859248
MgSO4 Sigma M2643
NaCl Sigma S5886
NTMT made in lab N/A 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20
OCT medium Tissue-Tek 4583
PAP pen Enzo Life Sciences ADI-950-233
Paraformaldehyde, 4% Abbexa abx082483 made in lab in 1x PBS
PBST (1x) made in lab N/A 1x PBS plus 0.1% Tween-20
Phenylthiourea Merck 103-85-5
Phosphate-buffered saline (10x) Invitrogen AM9624
preHYB made in lab N/A 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20
Proteinase K Roche 1092766
Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt Sigma R3629
RNase-free 1.5 mL tubes Ambion AM12400
SSC (20x) Invitrogen AM9770
SSCT (0.2x) made in lab N/A 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20
SSCT (1x) made in lab N/A 1x SSC plus 0.1% Tween-20
Sucrose Invitrogen 15503022
Triton X-100 Sigma T9284
Tween-20 Sigma P1379
Zebrafish Laboratory Animal Center of Nantong University N/A

References

  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  2. Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
  3. Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  4. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  5. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018)
  6. Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
  7. Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
  8. Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
  9. Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
  10. Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
  11. Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
  12. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  13. Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
  14. Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
  15. Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
  16. Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
  17. O’Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).

Play Video

Cite This Article
Wang, J., Chai, R., Fang, X., Gu, J., Xu, W., Chen, Q., Chen, G., Zhu, S., Jin, Y. In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (181), e63715, doi:10.3791/63715 (2022).

View Video