Ter plaatse Hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's
Summary
Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie van embryonale secties van zebravissen te combineren. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Het is nuttig om de expressiepatronen van twee genen in zebravissen te detecteren als er een tekort aan antilichamen is.
Abstract
Als gewerveld dier is de zebravis veel gebruikt in biologische studies. Zebravissen en mensen delen een hoge genetische homologie, waardoor het kan worden gebruikt als een model voor menselijke ziekten. Genfunctiestudie is gebaseerd op de detectie van genexpressiepatronen. Hoewel immunohistochemie een krachtige manier biedt om eiwitexpressie te testen, beperkt het beperkte aantal commercieel beschikbare antilichamen in zebravissen de toepassing van costaining. In situ hybridisatie wordt veel gebruikt in zebravisembryo’s om mRNA-expressie te detecteren. Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie te combineren voor embryosecties van zebravissen. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Immunohistochemie en de beeldvorming van een enkele cryosectie werden uitgevoerd na in situ hybridisatie. Het protocol is nuttig om het expressiepatroon van twee genen te ontrafelen, eerst door in situ transcriptdetectie en vervolgens door immunohistochemie tegen een eiwit in dezelfde sectie.
Introduction
De zebravis is een krachtig gewerveld model voor studies van ontwikkeling en genetica 1,2. Zebravissen en mensen delen een hoge genetische homologie (70% van de genen wordt gedeeld met het menselijk genoom), waardoor het kan worden gebruikt als model voor menselijke ziekten3. Bij zebravissen is het vrij gebruikelijk om de expressiepatronen van twee genen en hun ruimtelijke relatie te detecteren. Immunohistochemie werd voor het eerst gebruikt in 1941 om pathogenen in geïnfecteerde weefsels te detecteren door FITC-gelabelde antilichamen toe te passen4. Het doeleiwit in de weefselsectie wordt eerst gelabeld met een primair antilichaam en de sectie wordt vervolgens gelabeld met een secundair antilichaam tegen de gastheersoort immunoglobuline van het primaire antilichaam. Antilichaamkleuring is een robuuste aanpak om de lokalisatie van eiwitten te detecteren, die een hoge optische resolutie op intracellulair niveau biedt. Het aantal beschikbare antilichamen is echter zeer beperkt bij zebravissen. Een recente studie toont aan dat ongeveer 112.000 antilichamen commercieel beschikbaar zijn voor muizen; Er zijn echter zeer weinig antilichamen aangetoond die betrouwbaar zijn bij zebravissen5.
In plaats daarvan is in zebravissen in situ hybridisatie op grote schaal toegepast voor genexpressiepatroonanalyse. Deze methode werd voor het eerst gebruikt om genexpressie in Drosophila-embryo’s te beoordelen in de jaren 19806,7, en sindsdien is deze technologie voortdurend ontwikkeld en verbeterd. Aanvankelijk werden radioactief gelabelde DNA-sondes gebruikt om mRNA-transcripten te detecteren; De ruimtelijke resolutie was echter relatief laag en er waren potentiële gezondheidsrisico’s veroorzaakt door de radioactiviteit. Vervolgens is in situ hybridisatie afhankelijk van de RNA-sondes gelabeld met digoxigenine (DIG) of fluoresceïne (Fluo), die worden geconjugeerd tot alkalische fosfatase (AP) of gedetecteerd door fluorescerende tyramidesignaalversterking (TSA)8,9. Hoewel TSA is gebruikt om twee of drie genen te detecteren, zijn DIG-labeling van RNA-sondes en antiDIG AP-geconjugeerd antilichaam nog steeds zeer gevoelige, stabiele en veelgebruikte benaderingen voor in situ hybridisatie. Daarom zijn gecommercialiseerde antilichamen in combinatie met DIG-gelabelde in situ probes nuttig om inzicht te geven in eiwitlokalisatie en expressie van één gen.
Embryo’s met hele mounts kunnen de ruimtelijke relatie tussen genen niet onthullen vanwege de lage optische resolutie, ook al zijn zebravisembryo’s klein en transparant10. Daarom is sectionering noodzakelijk om de expressiepatronen van genen op intracellulair niveau te analyseren. Cryosectieing is veel gebruikt bij zebravissen omdat het gemakkelijk uit te voeren is en het antigeen effectief kan behouden. Daarom biedt in situ hybridisatie in combinatie met immunohistochemie in cryosecties van zebravissen een krachtige manier om de expressiepatronen van twee genen te analyseren. Een combinatie van in situ hybridisatie en immunohistochemie is toegepast op zebravissen11. Proteïnase K-behandeling werd echter gebruikt om de penetratie van de sonde te verbeteren ten koste van de antigeenintegriteit. Om deze beperking te overwinnen, gebruikt dit protocol verwarming om antigeenopvraging te induceren. Dit protocol is niet alleen van toepassing op embryo’s van verschillende stadia en weefselsecties van verschillende diktes (14 μm hoofdsecties en 20 μm ruggenmergsecties), maar het is ook geverifieerd met behulp van genen die tot expressie komen in twee organen, waaronder het hoofd en het ruggenmerg.
Dit artikel beschrijft hoe in situ hybridisatie en antilichaamkleuring in zebravisembryo’s in cryosecties kunnen worden gecombineerd. De veelzijdigheid van dit protocol wordt aangetoond door gebruik te maken van een aantal in situ hybridisatie-immunohistochemie combinaties, waaronder in situ hybridisatie probes voor twee verschillende neuronen. Deze methode is geschikt voor het detecteren van mRNA en eiwit in verschillende regio’s en embryo’s van verschillende leeftijden, evenals de expressiepatronen van twee genen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol stelt een combinatie voor van in situ hybridisatie en immunohistochemie, een belangrijke stap in de colokalisatie-experimenten op zebravisembryo’s. Deze methode dient als een eenvoudige en efficiënte manier om tegelijkertijd één mRNA en één eiwit te analyseren. In situ hybridisatie en antilichaamkleuring werden uitgevoerd op zebravisembryo’s. In tegenstelling tot verschillende protocollen die eerder 14,15,16 werden gepubliceerd,<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), de Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) en de Natural Science Foundation van de Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018)
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O’Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
