सीटू में क्रायोसेक्शनेड ज़ेबराफिश भ्रूण में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ संयुक्त संकरण
Summary
यह प्रोटोकॉल बताता है कि जेब्राफिश भ्रूण वर्गों के सीटू संकरण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में संयोजन करके छवियों को कैसे प्राप्त किया जाए। सीटू संकरण में क्रायोसेक्शनिंग से पहले किया गया था, इसके बाद एंटीबॉडी धुंधला हो गया था। एंटीबॉडी की कमी होने पर ज़ेबराफिश में दो जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न का पता लगाना उपयोगी है।
Abstract
कशेरुक के रूप में, जेब्राफिश का व्यापक रूप से जैविक अध्ययन में उपयोग किया गया है। ज़ेबराफ़िश और मनुष्य उच्च आनुवंशिक होमोलॉजी साझा करते हैं, जो मानव रोगों के लिए एक मॉडल के रूप में इसके उपयोग की अनुमति देता है। जीन फ़ंक्शन अध्ययन जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का पता लगाने पर आधारित है। यद्यपि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटीन अभिव्यक्ति को परख करने का एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है, जेब्राफिश में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी की सीमित संख्या कोस्टेनिंग के आवेदन को प्रतिबंधित करती है। एमआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए जेब्राफिश भ्रूण में सीटू संकरण का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि ज़ेबराफिश भ्रूण वर्गों के लिए सीटू संकरण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में संयोजन करके छवियों को कैसे प्राप्त किया जाए। सीटू संकरण में क्रायोसेक्शनिंग से पहले किया गया था, इसके बाद एंटीबॉडी धुंधला हो गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और एकल क्रायोसेक्शन की इमेजिंग सीटू संकरण के बाद की गई थी। प्रोटोकॉल दो जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न को उजागर करने में सहायक है, पहले सीटू ट्रांसक्रिप्ट डिटेक्शन द्वारा और फिर एक ही खंड में एक प्रोटीन के खिलाफ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा।
Introduction
जेब्राफिश विकास और आनुवंशिकी 1,2 के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली कशेरुक मॉडल है। ज़ेबराफ़िश और मनुष्य उच्च आनुवंशिक होमोलॉजी साझा करते हैं (70% जीन मानव जीनोम के साथ साझा किए जाते हैं), जोमानव रोगों के लिए एक मॉडल के रूप में इसके उपयोग की अनुमति देता है। ज़ेबराफ़िश में, दो जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न और उनके स्थानिक संबंध का पता लगाना काफी आम है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग पहली बार 1941 में एफआईटीसी-लेबल एंटीबॉडी4 को लागू करके संक्रमित ऊतकों में रोगजनकों का पता लगाने के लिए किया गया था। ऊतक अनुभाग में लक्ष्य प्रोटीन को पहले एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है, और फिर अनुभाग को प्राथमिक एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों इम्युनोग्लोबुलिन के खिलाफ एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है। एंटीबॉडी धुंधला प्रोटीन के स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण है, जो इंट्रासेल्युलर स्तर पर उच्च ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। हालांकि, ज़ेबराफ़िश में उपलब्ध एंटीबॉडी की संख्या बहुत सीमित है। हाल के एक अध्ययन से पता चलता है कि चूहों के लिए लगभग 112,000 एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं; हालांकि, जेब्राफिश5 में बहुत कम एंटीबॉडी विश्वसनीय साबित हुए हैं।
इसके बजाय, ज़ेबराफ़िश में, जीन अभिव्यक्ति पैटर्न विश्लेषण के लिए सीटू संकरण में व्यापक रूप से लागू किया गया है। इस विधि का उपयोग पहली बार 1980के दशक में ड्रोसोफिला भ्रूण में जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए किया गया था, और तब से, इस तकनीक को लगातार विकसित और बेहतर बनाया गया है। प्रारंभ में, एमआरएनए प्रतिलेख का पता लगाने के लिए रेडियोलेबल डीएनए जांच का उपयोग किया गया था; हालांकि, स्थानिक रिज़ॉल्यूशन अपेक्षाकृत कम था, और रेडियोधर्मिता के कारण संभावित स्वास्थ्य जोखिम थे। इसके बाद, सीटू संकरण में डिगोक्सीजेनिन (डीआईजी) या फ्लोरेसिन (फ्लुओ) के साथ लेबल किए गए आरएनए जांच पर निर्भर करता है, जो क्षारीय फॉस्फेट (एपी) के लिए संयुग्मित होते हैं या फ्लोरोसेंट टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए) 8,9 द्वारा पता लगाया जाता है। यद्यपि टीएसए का उपयोग दो या तीन जीनों का पता लगाने के लिए किया गया है, आरएनए जांच के डीआईजी लेबलिंग और एंटीडीआईजी एपी-संयुग्मित एंटीबॉडी अभी भी सीटू संकरण के लिए अत्यधिक संवेदनशील, स्थिर और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण हैं। इसलिए, डीआईजी-लेबल इन सीटू जांच के साथ संयुक्त व्यावसायिक एंटीबॉडी प्रोटीन स्थानीयकरण और एक जीन की अभिव्यक्ति में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए उपयोगी हैं।
कम ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन के कारण पूरे-माउंट भ्रूण जीन के बीच स्थानिक संबंध को प्रकट नहीं कर सकते हैं, भले ही ज़ेबराफ़िश भ्रूण छोटेऔर पारदर्शी हों। इसलिए, इंट्रासेल्युलर स्तर पर जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए सेक्शनिंग आवश्यक है। क्रायोसेक्शनिंग का व्यापक रूप से ज़ेबराफ़िश में उपयोग किया गया है क्योंकि यह प्रदर्शन करना आसान है और एंटीजन को प्रभावी ढंग से संरक्षित कर सकता है। इसलिए, जेब्राफिश क्रायोसेक्शन में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ संयुक्त सीटू संकरण दो जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है। जेब्राफिश11 पर सीटू संकरण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का एक संयोजन लागू किया गया है। हालांकि, एंटीजन अखंडता की कीमत पर जांच प्रवेश को बढ़ाने के लिए प्रोटीन के उपचार का उपयोग किया गया था। इस सीमा को दूर करने के लिए, यह प्रोटोकॉल एंटीजन पुनर्प्राप्ति को प्रेरित करने के लिए हीटिंग का उपयोग करता है। यह प्रोटोकॉल न केवल विभिन्न चरणों और विभिन्न मोटाई के ऊतक वर्गों (14 μm सिर अनुभाग और 20 μm रीढ़ की हड्डी के खंडों) के भ्रूण पर लागू होता है, बल्कि इसे सिर और रीढ़ की हड्डी सहित दो अंगों में व्यक्त जीन का उपयोग करके भी सत्यापित किया गया है।
यह लेख वर्णन करेगा कि क्रायोसेक्शन में ज़ेब्राफिश भ्रूण में सीटू संकरण और एंटीबॉडी धुंधलापन को कैसे संयोजित किया जाए। इस प्रोटोकॉल की बहुमुखी प्रतिभा को दो अलग-अलग न्यूरॉन्स के लिए सीटू संकरण जांच सहित कई सीटू संकरण-इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री संयोजनों का उपयोग करके प्रदर्शित किया जाता है। यह विधि विभिन्न क्षेत्रों और विभिन्न उम्र के भ्रूणों में एमआरएनए और प्रोटीन का पता लगाने के साथ-साथ दो जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए उपयुक्त है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल सीटू संकरण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के संयोजन का प्रस्ताव करता है, जो ज़ेबराफिश भ्रूण पर कोलोकलाइजेशन प्रयोगों में एक महत्वपूर्ण कदम है। यह विधि एक साथ एक एमआरएनए और एक प्रोटीन का …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के नानतोंग साइंस एंड टेक्नोलॉजी फाउंडेशन (MS12019011), चीन के नानतोंग साइंस एंड टेक्नोलॉजी फाउंडेशन (JC2021058), और जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थानों के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (21केजेबी 180009) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
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