In situ Hybridisering kombinert med immunhistokjemi i kryoseksjonerte sebrafiskembryoer
Summary
Denne protokollen beskriver hvordan man kan ta bilder ved å kombinere in situ hybridisering og immunhistokjemi av sebrafiskens embryonale seksjoner. In situ hybridisering ble utført før kryoseksjonering, etterfulgt av antistofffarging. Det er nyttig å påvise uttrykksmønstre av to gener hos sebrafisk hvis det er mangel på antistoffer.
Abstract
Som virveldyr har sebrafisken vært mye brukt i biologiske studier. Sebrafisk og mennesker deler høy genetisk homologi, noe som gjør det mulig å bruke det som en modell for menneskelige sykdommer. Genfunksjonsstudie er basert på påvisning av genuttrykksmønstre. Selv om immunhistokjemi tilbyr en kraftig måte å analysere proteinuttrykk på, begrenser det begrensede antallet kommersielt tilgjengelige antistoffer i sebrafisk anvendelsen av costaining. In situ hybridisering er mye brukt i sebrafiskembryoer for å oppdage mRNA-uttrykk. Denne protokollen beskriver hvordan man kan ta bilder ved å kombinere in situ hybridisering og immunhistokjemi for sebrafiskembryoseksjoner. In situ hybridisering ble utført før kryoseksjonering, etterfulgt av antistofffarging. Immunhistokjemi og avbildning av et enkelt kryosnitt ble utført etter in situ hybridisering. Protokollen er nyttig for å avdekke ekspresjonsmønsteret til to gener, først ved in situ transkriptdeteksjon og deretter ved immunhistokjemi mot et protein i samme seksjon.
Introduction
Sebrafisken er en kraftig virveldyrmodell for studier av utvikling og genetikk 1,2. Sebrafisk og mennesker deler høy genetisk homologi (70% av genene deles med det menneskelige genomet), noe som gjør det mulig å bruke det som en modell for menneskelige sykdommer3. Hos sebrafisk er det ganske vanlig å oppdage uttrykksmønstrene til to gener og deres romlige forhold. Immunhistokjemi ble først brukt i 1941 for å oppdage patogener i infisert vev ved å bruke FITC-merkede antistoffer4. Målproteinet i vevsseksjonen merkes først med et primært antistoff, og seksjonen blir deretter merket med et sekundært antistoff mot det primære antistoffets vertsart immunoglobulin. Antistofffarging er en robust tilnærming for å oppdage lokalisering av proteiner, som gir høy optisk oppløsning på intracellulært nivå. Antallet tilgjengelige antistoffer er imidlertid svært begrenset hos sebrafisk. En fersk studie viser at omtrent 112 000 antistoffer er kommersielt tilgjengelige for mus; Imidlertid har svært få antistoffer vist seg å være pålitelige i sebrafisk5.
I stedet, i sebrafisk, har in situ hybridisering blitt mye brukt for analyse av genuttrykksmønster. Denne metoden ble først brukt til å vurdere genuttrykk i Drosophila-embryoer på 1980-tallet6,7, og siden da har denne teknologien blitt kontinuerlig utviklet og forbedret. I utgangspunktet ble radiomerkede DNA-prober brukt til å oppdage mRNA-transkripter; Den romlige oppløsningen var imidlertid relativt lav, og det var potensielle helserisikoer forårsaket av radioaktiviteten. Deretter er in situ-hybridisering avhengig av RNA-probene merket med digoksigenin (DIG) eller fluorescein (Fluo), som er konjugert til alkalisk fosfatase (AP) eller detektert ved fluorescerende tyramidsignalforsterkning (TSA) 8,9. Selv om TSA har blitt brukt til å oppdage to eller tre gener, er DIG-merking av RNA-prober og antiDIG AP-konjugert antistoff fortsatt svært følsomme, stabile og mye brukte tilnærminger for in situ hybridisering. Derfor er kommersialiserte antistoffer kombinert med DIG-merkede in situ-sonder nyttige for å gi innsikt i proteinlokalisering og ekspresjon av ett gen.
Helmonterte embryoer kan ikke avsløre det romlige forholdet mellom gener på grunn av den lave optiske oppløsningen, selv om sebrafiskembryoer er små og gjennomsiktige10. Derfor er seksjonering nødvendig for å analysere ekspresjonsmønstrene til gener på intracellulært nivå. Kryoseksjonering har vært mye brukt i sebrafisk, da det er lett å utføre og effektivt kan bevare antigenet. Derfor tilbyr in situ-hybridisering kombinert med immunhistokjemi i sebrafiskkryoseksjoner en kraftig måte å analysere uttrykksmønstrene til to gener på. En kombinasjon av in situ hybridisering og immunhistokjemi er anvendt på sebrafisk11. Imidlertid ble proteinase K-behandling brukt til å forbedre sondepenetrasjonen på bekostning av antigenintegritet. For å overvinne denne begrensningen bruker denne protokollen oppvarming for å indusere antigeninnhenting. Denne protokollen gjelder ikke bare embryoer av forskjellige stadier og vevsseksjoner av forskjellige tykkelser (14 μm hodeseksjoner og 20 μm ryggmargsseksjoner), men den har også blitt verifisert ved å bruke gener uttrykt i to organer, inkludert hodet og ryggmargen.
Denne artikkelen vil beskrive hvordan man kombinerer in situ hybridisering og antistofffarging i sebrafiskembryoer i kryoseksjoner. Allsidigheten til denne protokollen er demonstrert ved å bruke en rekke in situ hybridisering-immunhistokjemi kombinasjoner, inkludert in situ hybridiseringsprober for to forskjellige nevroner. Denne metoden er egnet for å oppdage mRNA og protein i forskjellige regioner og embryoer av forskjellige aldre, samt uttrykksmønstrene til to gener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen foreslår en kombinasjon av in situ hybridisering og immunhistokjemi, et viktig skritt i samlokaliseringsforsøkene på sebrafiskembryoer. Denne metoden fungerer som en enkel og effektiv måte å samtidig analysere ett mRNA og ett protein. In situ hybridisering og antistofffarging ble utført på sebrafiskembryoer. I motsetning til flere protokoller publisert tidligere14,15,16, ble immunfluorescens og im…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) og Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018)
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O’Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
