Summary
번역 후 변형(PTM)은 단백질 구조와 기능을 변화시킵니다. 여러 PTM 유형을 동시에 농축하는 방법은 분석에서 적용 범위를 최대화할 수 있습니다. 우리는 이중 작용성 Ti (IV) 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 사용한 프로토콜을 제시하고 췌장 조직에서 단백질 N- 글리코실화 및 인산화의 동시 농축 및 분석을 위해 질량 분광법을 제시합니다.
Abstract
질량 분광법은 번역 후 변형 (PTM)에 대한 깊은 범위를 제공 할 수 있지만, 복잡한 생물학적 매트릭스로부터의 이러한 변형의 농축은 종종 비 변형 된 분석물에 비해 낮은 화학량론으로 인해 필요합니다. 상향식 프로테오믹스 워크플로우에서 펩티드에 대한 PTM의 대부분의 농축 워크플로우는 생성된 펩티드가 분석되기 전에 단백질이 효소적으로 소화되고, 오직 한 가지 유형의 변형만을 풍부하게 한다. 그러나 PTM의 전체 보완은 생물학적 기능을 유도하고 단일 유형의 PTM의 농축은 PTM의 이러한 누화를 놓칠 수 있습니다. PTM 누화는 단백질 글리코실화와 인산화 사이에서 관찰되었으며, 인간 단백질에서 가장 일반적인 두 가지 PTM과 질량 분광법 워크 플로우를 사용하여 가장 많이 연구 된 두 가지 PTM입니다. 본원에 기재된 동시 농축 전략을 사용하여, 두 PTM 모두 사후 인간 췌장 조직, 복잡한 생물학적 매트릭스로부터 농축된다. 이중 작용성 Ti(IV) 고정화 금속 친화성 크로마토그래피는 편리한 스핀 팁 기반 방법으로 여러 분획에서 다양한 형태의 글리코실화 및 인산화를 동시에 분리하는 데 사용되므로 잠재적인 PTM 누화 상호작용의 다운스트림 분석이 가능합니다. 글리코 및 포스포펩타이드에 대한 이러한 농축 워크플로우는 다양한 샘플 유형에 적용되어 여러 PTM의 심층 프로파일링을 달성하고 향후 연구를 위한 잠재적 표적 분자를 식별할 수 있습니다.
Introduction
단백질 번역 후 변형 (PTM)은 단백질 구조와 결과적으로 기능 및 하류 생물학적 과정을 조절하는 데 중요한 역할을합니다. 인간 프로테옴의 다양성은 다양한 PTM에 의해 제공되는 조합 변동성으로 인해 기하 급수적으로 증가합니다. 게놈에 의해 예측 된 바와 같이 정준 서열로부터의 단백질의 다른 변이체는 프로테오폼으로 알려져 있으며, 많은 프로테오형은 PTMs1에서 발생합니다. 건강과 질병의 프로테오폼 다양성을 연구하는 것은 최근 몇 년 동안 큰 관심의 연구 분야가되었습니다 2,3.
더 깊은 깊이를 가진 프로테오폼 및 보다 구체적으로 PTM에 대한 연구는 질량 분광분석법(MS) 기반 프로테오믹스 방법의 개발을 통해 더욱 용이해졌다. MS를 사용하여, 분석물은 이온화되고, 단편화되고, 단편화되고, 단편의 m/z 에 기초하여 식별된다. 농축 방법은 종종 단백질의 비 변형 형태에 비해 PTM의 상대적 풍부도가 낮기 때문에 필요합니다. 하향식 분석이라고 불리는 손상되지 않은 단백질과 PTM의 분석이 더욱 일상화되었지만, 단백질의 효소 소화와 상향식 분석에서 구성 요소 펩티드의 분석은 여전히 PTM 분석에 가장 널리 사용되는 경로입니다. 가장 널리 연구된 두 개의 PTM과 생체내에서 가장 흔한 두 개의 PTM은 글리코실화와 인산화4이다. 이 두 PTM은 세포 신호 전달 및 인식에 중요한 역할을하므로 질병 연구에서 특성화하는 중요한 변형입니다.
다양한 PTM의 화학적 특성은 종종 분석 전에 단백질 및 펩티드 수준에서 이러한 PTM을 농축하는 경로를 제공합니다. 글리코실화는 각 단당류에 히드록실기가 풍부하기 때문에 친수성 PTM이다. 이러한 특성은 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)에서 글리코펩티드를 풍부하게 하는데 사용될 수 있으며, 이는 소수성 비변형된 펩티드5로부터 더 친수성 글리코펩티드를 분리할 수 있다. 인산화는 산성 pH를 제외하고 음전하를 띤 포스페이트 모이어티를 추가한다. 이러한 전하로 인해 티타늄을 포함한 다양한 금속 양이온을 사용하여 포스포 펩타이드를 유인하고 결합 할 수 있으며 비 인산화 된 종은 씻겨 나갈 수 있습니다. 이것은 고정화 된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)의 원리입니다. 글리코실화 및 인산화를 위한 이들 및 다른 농축 전략에 대한 추가 논의는 최근 리뷰 6,7에서 찾을 수 있다.
비교적 많은 양의 출발 펩티드 물질 (0.5 mg 이상)은 펩티드 상의 PTMs의 낮은 화학량론으로 인해 농축 프로토콜에 종종 필요하다. 종양 코어 생검 또는 뇌척수액 분석과 같이 이러한 양의 샘플을 쉽게 얻을 수 없는 시나리오에서는 최대 생체 분자 정보를 생성하는 facile 워크플로우를 사용하는 것이 좋습니다. 우리 연구실과 다른 사람들이 개발 한 최근의 전략은 동일한 PTM 농축 워크 플로 8,9,10,11,12를 사용하여 글리코실화 및 인산화의 동시 및 병렬 분석을 강조했습니다. 이 두 PTM의 화학적 특성은 다를 수 있지만 이러한 PTM은 혁신적인 분리 기술 및 사용 된 재료로 인해 여러 단계로 분석 될 수 있습니다. 예를 들어, 정전기 반발-친수성 상호작용 크로마토그래피(ERLIC)는 분석물과 이동상 사이의 친수성 상호작용에 기초한 분리를 분석물과 고정상 물질 사이의 전하-전하 상호작용(13,14,15,16)에 기초하여 분리를 오버레이한다. 산성 pH에서, 고정상으로의 인산화된 펩티드의 인력은 그들의 보유 및 비변형된 펩티드로부터의 분리를 향상시킬 수 있다. 친수성 미소 구체 상에 고정화된 Ti(IV)로 구성된 물질은 포스포펩티드와 중성, 산성 및 만노스-6-인산화된 글리코펩티드17,18을 분리하기 위해 HILIC 및 IMAC 기반 용출에 사용될 수 있다. 이 전략은 이중 기능 Ti(IV)-IMAC로 알려져 있습니다. 단일 워크플로우에서 여러 PTM을 보강하기 위해 이러한 전략을 사용하면 잠재적인 PTM 누화 상호 작용에 대한 분석에 더 쉽게 액세스할 수 있습니다. 추가적으로, 총 샘플 양 및 시간 요건은 병렬로 수행될 때 종래의 농축 방법(즉, 개별 샘플 분취량 상의 HILIC 및 IMAC)보다 작다.
단백질 글리코실화 및 인산화의 동시 분석을 위한 이중 기능적 Ti(IV)-IMAC 전략을 입증하기 위해, 우리는 사후 인간 췌장 조직을 분석하기 위해 이를 적용했습니다. 췌장은 인슐린과 글루카곤을 포함한 소화 효소와 조절 호르몬을 모두 생산합니다. 췌장 기능은 췌장 질환에서 손상됩니다. 당뇨병에서는 혈당 조절이 영향을 받아 혈액 내 포도당 수치가 높아집니다. 췌장염에서 염증은 장기의 자동 소화로 인해 발생합니다3. 글리코실화 및 인산화를 포함한 PTM 프로파일의 변화는 종종 그렇듯이 다른 질병에서 발생할 수 있습니다.
여기에서는 췌장 조직에서 추출한 단백질로부터 유래된 N-글리코펩티드 및 포스포펩티드에 대한 이중 기능성 Ti(IV)-IMAC 전략에 기초한 스핀팁 기반 동시 농축 방법에 대한 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이 단백질 추출 및 소화, 농축, MS 데이터 수집 및 데이터 처리를 포함한다. 이 연구의 대표적인 데이터는 식별자 PXD033065를 가진 ProteomeXchange 컨소시엄을 통해 구할 수 있습니다.
그림 1: 인간 췌장 조직에서 N-글리코펩티드와 포스포펩티드를 동시에 분석하기 위한 워크플로우. 조직은 먼저 세제 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 사용하여 단백질 추출 전에 미세한 분말로 분쇄된다. 그런 다음 단백질은 효소 소화를 받는다. 생성된 펩티드는 이중 작용성 Ti(IV)-IMAC를 사용하여 농축하기 전에 분취된다. 원시 데이터는 나노 스케일 역상 액체 크로마토그래피 - 질량 분광법 (nRPLC-MS)을 사용하여 수집되며 데이터베이스 검색 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 프로토콜은 PTM 분석의 접근성을 높이고 동일한 워크플로우에서 여러 PTM을 보다 광범위하게 분석할 수 있도록 하기 위한 것입니다. 이 프로토콜은 세포 및 생체유체를 포함한 다른 복잡한 생물학적 매트릭스에 적용될 수 있다.
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Protocol
고인의 다음 친족으로부터 연구를 위해 췌장 조직을 사용하는 것에 대한 동의가 얻어졌으며 위스콘신-매디슨 대학 건강 과학 기관 검토위원회의 승인을 받았다. IRB 감독은 45 CFR 46.102 (f)에 의해 인정 된 인간 피험자를 포함하지 않기 때문에 필요하지 않습니다.
주의: 산(포름, 아세틱, 트리플루오로아세트산), 염기(수산화암모늄) 및 저온(액체 질소)을 포함하는 이 프로토콜에 사용되는 시약을 취급할 때는 주의해야 합니다. 관련 위험 및 필요한 예방 조치에 익숙해지는 데 사용되는 시약에 대한 안전 데이터 시트를 읽으십시오. 백분율을 사용하여 표시된 농도는 부피 / 총 부피 (v / v)이며 물로 희석됩니다.
1. 조직 냉동 분쇄, 용해 및 단백질 추출
- 액체 질소로 탈전을 채 웁니다. 췌장 조직과 접촉 할 조직 분쇄기의 부분, 즉 챔버, 분쇄기 및 회수 스푼을 폴리스티렌 용기에 미리 식히십시오.
- 냉동 조직 조각을 미리 냉각 된 샘플 홀더로 옮기고 한 스푼의 액체 질소를 조직에 첨가하십시오.
- 분쇄기를 챔버에 넣고 다섯 번에서 열 번 망치를 사용하여 샘플을 분쇄하십시오. 챔버에서 분쇄기를 제거하고 부착 된 조직 분말과 조각을 긁어 내십시오.
- 조직이 녹기 시작하면 한 숟가락의 액체 질소를 챔버에 넣으십시오. 샘플이 큰 조직 덩어리가없는 미세 분말이 될 때까지 분쇄 과정을 반복하십시오. 샘플을 약 100mg 분취량으로 미리 냉각된 튜브에 분담한다.
- 4% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 150 mM NaCl 및 25 mM 트리스(pH = 7.4)를 함유하는 용해 완충액을 준비한다. 프로테아제 및 포스파타제 억제제 각각을 500 μL의 물에 각각 하나의 정제를 20x 스톡에 용해시킨다. 최종 1x 농도를 위해 용해 완충액에 각 억제제의 20x 스톡의 필요한 부피를 첨가한다.
- 조직 100 mg 당 600 μL의 용해 완충액을 튜브에 첨가하고, 800 rpm에서 진탕하면서 10분 동안 가열 블록에서 95°C에서 인큐베이션한다. 가열 블록에서 샘플을 제거하고 실온으로 식히십시오.
- 60W 에너지(20kHz)에서 45초 동안 샘플을 초음파 처리하고, 그 사이에 30초 동안 15s 펄스를 사용합니다. 샘플을 4°C에서 15분 동안 3,000 x g 에서 펠릿화한다.
- 상청액을 50% 아세톤, 49.9% 에탄올 및 0.1% 아세트산을 함유하는 침전 용매 1.5 mL에 용해 완충액 300 μL의 5x 침전 용매에 첨가한다. -20°C에서 하룻밤 동안 식힌다.
- 샘플을 다시 3,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 펠릿화하고 상청액을 제거하였다. 주걱으로 분해하고 동일한 양의 침전 용매와 혼합하여 펠렛을 세척한다. 펠릿을 다시 2x 세척 단계를 반복한다.
- 샘플을 4°C에서 15분 동안 16,000 x g 에서 펠릿화하였다. 샘플 펠릿을 흄 후드에서 15분 동안 공기 건조시키고 진행될 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관한다.
2. 단백질 소화 및 탈염
- 단백질 펠릿을 50 mM 트리에틸암모늄 중탄산염(TEAB) 및 8 M 우레아를 함유하는 갓 만든 소화 완충액 300 μL에 재현탁시킨다.
- 제조자의 프로토콜에 따라 단백질 분석을 사용하여 용액의 단백질 농도를 추정한다.
- 용액 중의 단백질에 디티오트레이톨 (DTT)을 최종 농도 5 mM로 첨가하고, 혼합하고, 실온에서 1 h 동안 감소시킨다. 이어서, 요오도아세트아미드 (IAA)를 최종 농도 15 mM로 첨가하고, 어둠 속에서 30분 동안 실온에서 알킬레이트를 혼합하고, 알킬레이트한다. DTT의 첨가를 이전과 동일한 부피로 반복함으로써 알킬화를 켄칭하고 혼합한다.
- 1:100 효소:단백질 비율에서 LysC/트립신을 첨가하고, 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 1 M을 <하기 위해 사용된 8 M 우레아를 희석하기 위해 50 mM TEAB를 첨가한다. 1:100 효소:단백질 비로 트립신을 첨가하고, 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
- 트리플루오로아세트산 (TFA)을 0.3 % v / v로 첨가하여 소화를 진정시킵니다. 시작 단백질 1mg마다 탈염 카트리지(1cc, 10mg)를 1mL의 아세토니트릴(ACN)과 1mL의 0.1% TFA로 3x를 컨디셔닝합니다.
- 소화된 혼합물을 탈염 카트리지 상에 로딩한다. 혼합물을 0.1% TFA 1 mL를 사용하여 3x 세척한다. 용출이 느린 경우 양압을 가하되 초당 한 방울> 유속을 피하십시오.
- 1 mL의 60% ACN 및 0.1% 포름산(FA) 용액을 사용하는 엘루트 펩티드. 용출된 펩티드를 용매가 완전히 증발될 때까지 원심 진공 농축기를 사용하여 대략 35°C에서 건조시킨다.
- 펩티드를 300 μL의 물에 재현탁시키고 제조자의 프로토콜에 따라 펩티드 검정을 사용하여 펩티드 농도를 추정한다. 펩티드를 500 μg 분취량으로 분할하고 완전히 건조시킨다.
3. ERLIC N-글리코펩티드 농축
참고: 정확한 원심분리 속도와 시간은 샘플에 따라 다를 수 있으므로 최적화해야 합니다. 일반적으로, 2분 동안 300 x g는 물질의 컨디셔닝 및 세척에 적합하고, 용출을 위해 5분 동안 100 x g이다.
- 면봉의 약 3mg의 무게를 측정하여 빈 200μL 피펫 팁에 포장하십시오 (스핀 팁, 재료 표 참조).
- 강한 음이온 교환 농축 물질을 튜브로 옮기고 재료 10mg 당 0.1 % TFA 200 μL를 첨가하십시오. 500 μg의 펩티드를 농축하려면 15mg의 물질을 사용하십시오. 15 분 동안 흔들어서 재료를 활성화하십시오.
- 튜브 어댑터를 사용하여 스핀 팁을 2mL 튜브 위에 놓고 15mg의 재료를 팁에 충분한 슬러리를 첨가하십시오. 벤치탑 원심분리기에서 회전하여 액체를 제거하십시오.
- 200 μL의 ACN으로 3x를 원심분리하여 물질을 컨디셔닝한다. 100 mM 아세트산암모늄 (NH4Ac), 1% TFA 및 80% ACN/0.1% TFA (로딩 완충액)를 사용하여 삼중 컨디셔닝을 반복한다.
- 500 μg 펩티드 샘플을 대략 200 μL의 로딩 완충액에 재현탁시키고 스핀-팁을 통해 유동시킨다. 완전한 바인딩을 보장하기 위해 플로우 스루 2x를 다시 로드하십시오.
- 200 μL의 80% ACN/0.1% TFA를 사용하여 5x를 원심분리한 다음, 80% ACN/0.1% FA의 200 μL를 사용하여 2x 원심분리하여 물질을 세척한다.
- 다음의 각각을 200 μL로 원심분리하여 펩티드를 희석한다: 50% ACN/0.1% FA (E1); 0.1% FA (E2); 0.1% TFA (E3); 300 mMKH2PO4, 10% ACN (E4).
- 2x를 80% ACN/5%NH4OH의 200 μL로 원심분리하여 물질을 세척한다. 나머지 펩티드를 200 μL의 10%NH4OH(E5)로 희석한다.
- 모든 용출액을 대략 35°C에서 원심 진공 농축기를 사용하여 완전히 건조시킨다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 탈염 팁을 사용하여 기본 용출 (E5)의 탈염을 수행하십시오.
- 탈염 팁으로부터의 용출을 대략 35°C에서 원심 진공 농축기를 사용하여 완전성으로 건조시킨다.
4. Ti(IV)-IMAC 포스포펩타이드 농축
참고: 정확한 원심분리 속도와 시간은 샘플에 따라 다를 수 있으므로 최적화해야 합니다. 일반적으로, 2분 동안 300 x g는 물질의 컨디셔닝 및 세척에 적합하고, 용출을 위해 5분 동안 100 x g이다.
- 면봉의 무게를 약 3mg으로 측정하여 빈 200μL 피펫 팁(스핀 팁)에 포장합니다.
- Ti-IMAC 포스포펩티드 농축 물질을 튜브로 옮기고 물질 10mg 당 0.1% TFA 200μL를 첨가한다. 500 μg 펩티드를 농축하려면 10mg의 물질을 사용하십시오.
- 튜브 어댑터를 사용하여 스핀 팁을 2mL 튜브 위에 놓고 10mg 재료의 팁에 충분한 슬러리를 추가합니다. 벤치탑 원심분리기에서 회전하여 액체를 제거하십시오.
- 상기 기재된 바와 동일한 원심분리 설정을 사용하여 200 μL의 40% ACN/3% TFA로 물질을 컨디셔닝한다. 펩티드 샘플을 40% ACN/3% TFA의 200 μL에 재현탁시키고 스핀 팁을 통해 유동시킨다. 흐름 스루를 두 번 다시 로드하여 보다 완벽한 바인딩을 보장합니다.
- 200 μL의 50% ACN, 6% TFA 및 200 mM NaCl 용액으로 원심분리하여 물질을 세척하고, 이어서 200 μL의 30% ACN 및 0.1% TFA 용액에서 2x 세척하였다.
- 200 μL의 10%NH4OH를 갖는 에루트 펩티드. 용출을 진공 하에서 완전히 건조시킵니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 탈염 팁을 사용하여 탈염을 수행하십시오. 탈염 팁에서 용출을 진공 하에서 완전성으로 건조시킵니다.
5. 이중 기능 Ti (IV) 동시 농축
참고: 정확한 원심분리 속도와 시간은 샘플에 따라 다를 수 있으므로 최적화해야 합니다. 일반적으로, 2분 동안 300 x g는 물질의 컨디셔닝 및 세척에 적합하고, 용출을 위해 5분 동안 100 x g이다.
- 면봉의 무게는 약 3mg이며 빈 스핀 팁에 포장하십시오.
- 약 1g의 Ti(IV)-IMAC 물질을 튜브에 옮깁니다. 0.1% TFA를 공지된 농도의 물질, 예를 들어 20 mg/200 μL에 첨가한다(물질은 4°C에서 이 현탁액에 저장될 수 있다).
- 500 μg 펩티드로부터 농축을 위해, 20 mg의 물질을 옮기기 위해 스핀 팁에 충분한 슬러리를 첨가한다. 스핀-팁을 0.1% TFA의 200 μL로 원심분리하여 세척한다.
- 샘플을 200μL의 로딩/세척 용매(80% ACN 및 3% TFA)에 재현탁하고 스핀 팁을 통해 흐릅니다. 플로우 스루 2x를 다시로드하십시오.
- 200 μL의 로딩/세척 용매로 원심분리하여 스핀 팁 6x를 세척하십시오. 스핀 팁을 80% ACN/0.1% FA 용액 200μL로 세척한다.
- 펩티드를 다음의 각각인 200 μL로 희석한다: 60% ACN/0.1% FA (E1) 및 40% ACN/0.1% FA (E2). 각 용출을 개별적으로 분석하십시오.
- 펩티드를 각각 200 μL로 희석한다: 20% ACN/0.1% FA 및 0.1% FA. 두 용출액을 결합하고 하나의 샘플(E3)로 분석한다.
- 펩티드를 200 μL의 다음 각각으로 희석한다: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200 mM NaCl; 및 30 % ACN / 0.1 % TFA. 이러한 용출을 결합하고 패킹된 팁을 사용하여 탈염한 후 하나(E4)로서 분석한다.
- 물질을 3x에 대해 90% ACN/2.5%NH4OH의 200 μL를 사용하여 염기성 pH로 조건화한다. 이 세척은 버리십시오.
- 펩티드를 다음의 각각: 60% ACN/10% NH4OH (E5) 및40% ACN/10%NH4OH(E6) 중 200 μL로 분리한다. 포장 된 팁을 사용하여 탈염 한 후 이러한 용출을 별도로 분석하십시오.
- 펩티드를 각각 200 μL로 희석한다: 20% ACN/10%NH4OH; 10% ACN/10%NH4OH; 및 10%NH4OH. 이러한 용출을 결합하고 패킹된 팁을 사용하여 탈염 후 하나(E7)로서 분석한다.
- 모든 용출액을 진공 하에서 완전히 건조시킵니다.
6. 나노 흐름 역상 액체 크로마토그래피 - 질량 분광법 (nRPLC-MS)
참고: MS 데이터 수집 및 분석 방법은 다양하므로 제안된 LC-MS 파이프라인(및 관련 파라미터)은 다음 단계에서 하나만 여기에 설명되어 있습니다. 이전에 요약된 샘플 준비 및 농축 단계를 사용하여 생성된 샘플은 충분한 데이터 품질이 주어지면 상업적으로 이용가능한 크로마토그래피 컬럼을 사용하는 것을 포함하여 다른 도구적 셋업을 사용하여 분석될 수 있다.
- 19에 기재된 바와 같이 C18 재료를 사용하여 15 cm 길이의 모세관(75 μm 내경)을 당겨서 포장한다. 이동상 A(물 중 0.1% FA) 및 이동상 B(ACN에서 0.1% FA)를 준비합니다.
- 농축된 펩티드 샘플을 15 μL의 3% 이동상 B. 2 μL의 샘플(∼13% 샘플 부피)을 컬럼 상에 직접 재구성한다. 기술 복제본으로 각 샘플을 분석합니다.
- 0.3 μL/min의 유속으로 90분에 걸쳐 3% 내지 30% 이동상 B의 구배를 사용하는 Elute 펩티드. 컬럼을 8분 동안 75% B를 사용하여 세척한 다음, 8분 동안 95% B로 세척하고, 12분 동안 3% B에서 평형화로 방법을 마무리하였다.
- 다음 파라미터로 상위 20개 피크의 데이터 의존적 수집을 사용하여 포지티브 이온 모드에서 질량 분광계를 작동시킨다: 스프레이 전압 2kV; 120,000 분해능에서 400-2,000 m/z에서 LC/MS에서 MS 1 검출, 2E5 자동 이득 제어(AGC) 타겟, 100ms 최대 주입 시간, 30% RF 렌즈, 1.6 m/z 윈도우를 갖는 사중극자 절연, 충전 상태 2-8 및 미결정, 30초 동적 배제; LC/MS에서 MS 2 검출은 22%, 30% 및 38%의 계단식 HCD 단편화를 사용하고, 30,000 분해능에서 첫 번째 질량 120m/z를 고정하고, 5E4 AGC 타겟 및 2.5E4 최소 강도 요구 사항에서 고정했습니다.
7. MS 데이터 분석
참고: 두 개의 서로 다른 소프트웨어를 사용하여 동일한 데이터 세트를 분석하는 하나의 데이터 분석 파이프라인이 여기에 나와 있습니다. 인산화 및 글리코실화는 여기에 설명된 바와 같이 두 개의 개별 소프트웨어 대신에 단일 소프트웨어를 사용하여 동시에 검색될 수 있지만, 일반적으로, 소프트웨어 검색 시간은 검색 공간, 즉 고려되는 PTM의 수에 비례한다. 이러한 이유로, 두 개의 상이한 소프트웨어가 글리코펩티드 및 포스포펩티드에 대한 검색과 병행하여 사용된다.
- 적절한 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터 파일을 처리합니다( 자료 표 참조).
- UniProt 인간 (또는 적절한 종 별) 데이터베이스에 대한 스펙트럼을 검색하십시오. Cys의 카르바미도메틸화를 고정된 변형으로 설정한다. 누락된 효소 절단의 최대 수를 두 개로 설정합니다.
- 원시 데이터 파일에서, 상용 소프트웨어( 표 참조)를 사용하여, 분석될 글리코펩티드를 검색한다(20). 네 개의 잔기의 최소 펩티드 길이를 갖는 10ppm 전구체 질량 공차 및 0.01 Da 단편 질량 허용오차를 사용한다.
- HexNAc(2)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Phospho(1) 및 HexNAc(3)Hex(3-4)Phospho(1)를 포함한 일반적인 만노스-6-포스페이트(M6P)글리칸으로 확장된 소프트웨어 임베디드 N-글리칸 데이터베이스를 사용하여 검색합니다.
- N-글리코실화를 일반적인 변형으로 설정한다. 펩티드 스펙트럼 매치 (PSM) 당 최대 총 변형을 하나의 공통 및 두 개의 희귀 한 것으로 설정하십시오.
- 다음과 같은 변수 변형을 설정하십시오 : Met의 산화 (드물게), Asn 및 Gln에서의 탈아미드화 (드물게), Ser, Thr 및 Tyr (공통)에서의 인산화. 다음 식별 필터를 설정합니다: 점수 컷오프 > 150, |log prob| > 1, 델타 모드 점수> 10입니다.
- 단백질 및 펩티드 그룹 탭에서 검색 결과를 내보내고 분석합니다.
- MS/MS 스펙트럼에서 PhosphoHex 옥소늄 이온( 243m/z)의 존재에 대해 M6P 글리칸을 포함하는 식별을 수동으로 스크리닝하고 이 진단 이온을 포함하지 않는 위양성 식별을 제거합니다.
- 원시 데이터 파일에서, 오픈 소스 소프트웨어( 표 참조)를 사용하여, 분석될 포스포펩티드를 검색한다(21). 20 ppm 첫 번째 탐색 펩티드 내성 및 4.5 ppm 주 탐색 펩티드 허용오차를 사용한다.
- 펩티드당 최대 변형 횟수를 5로 설정한다. PSM 및 단백질 허위 발견률(FDR)을 1%로 설정하고 최소 펩티드 길이를 7개의 잔기로 설정한다.
- 가변 변형을 Met에서의 산화, N 말단 단백질 아세틸화 및 Ser, Thr 및 Tyr에서의 인산화로 설정하십시오. modificationSpecificPeptides 파일을 사용하여 검색 결과를 분석합니다.
- 단백질, 펩티드 및 변형 부위 수준에서 PTM의 동정 횟수를 결정한다.
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Representative Results
원시 파일 및 검색 결과를 포함한 대표적인 질량 분석 데이터는 데이터 세트 식별자 PXD03306522가 있는 PRIDE 파트너 리포지토리를 통해 ProteomeXchange 컨소시엄에 보관되었습니다.
이 작업에서, 각각의 농축 용리에 대해 중복 주입 반복실험이 분석되었다. 두 기술 반복실험에서 이루어진 식별은 최종 분석에서 대조되었습니다. MS/MS 단편화를 위한 펩티드 전구체를 선별할 때 데이터 의존적 획득의 반확률적 특성으로 인해, 기술적 중복들 사이에서 약 70%-80%의 식별 중첩이 예상된다. 이러한 방법을 사용하는 응용 프로그램에서는 적어도 두 개의 기술적 반복실험이 권장됩니다. 다운스트림 통계 분석의 경우, 다양한 실험 조건에 대한 생물학적 반복실험을 고려해야 합니다. 데이터 보고를 위한 원하는 엄격성에 따라, 보고될 식별, 예를 들어, 적어도 x 개수의 기술적 또는 생물학적 반복실험에서의 식별을 위한 필터를 설정하는 것이 유용할 수 있다.
각 농축물로부터의 각각의 용출에 대한 예시적인 총 이온 크로마토그램(TIC)은 보충도 S1, 보충도 S2, 및 보충도 S3에서 볼 수 있다. 원시 MS 파일의 데이터베이스 검색 중에 엄격한 필터를 사용하면 PTM을 사용하는 펩티드 서열에 대한 MS/MS 스펙트럼의 보다 정확하고 확실한 식별을 보장할 수 있습니다. 각각의 용출에 대한 TICs에서 명백한 바와 같이, 펩티드 샘플은 농축으로부터 분획화 후에도 여전히 복잡하다. 고분해능, 고질량 정확도 및 빠른 스캐닝 질량 분광계에 결합 된 나노 플로우 크로마토그래피는 트립틱 다이제스트의 펩타이드와 같은 복잡한 혼합물을 큰 감도와 깊이로 분석하는 데 도움이 될 수 있습니다. 당화 및 인산화 스펙트럼에 대한 실시예 MS/MS 스펙트럼은 도 2에서 볼 수 있다. 이와 같은 잘 주석 달린 스펙트럼은 데이터베이스 검색 소프트웨어에 의해 할당 된 식별에 대한 신뢰도를 증가시키는 전구체의 풍부한 단편화로 인해 발생합니다.
도 3은 각 용출 분획에 걸쳐 이중 작용성 Ti(IV)-IMAC 스핀-팁 농축 방법을 사용하여 이루어진 펩티드 동정을 도시한다. 대부분의 글리코펩티드는 처음 네 개의 분획에서 용출되는 반면, 대부분의 포스포펩티드는 마지막 세 분획에서 용출된다. 분획들 사이에서 서로 다른 PTM을 분리하는 것은 용출 전반에 걸쳐 적절하게 분리되지 않은 경우 발생할 수있는 이온화의 간섭을 방지하는 데 도움이됩니다.
도 4는 ERLIC 글리코펩티드 단독 농축과 비교한 이중 Ti 방법으로부터의 글리코프로테오믹스 결과를 비교한다. 도 4A에서 알 수 있는 바와 같이, 단백질, 글리코폼, PTM 및 변형 부위 수준에서의 많은 동정은 두 방법 모두에 공통적이다. 그러나 ERLIC은 이중 Ti 방법에 비해 모든 수준에서 더 독특한 식별을 가지고 있습니다. 여기에는 M6P (적어도 하나의 인산염 그룹을 가진 고 만노스 글리칸) 글리코폼이 포함되며, 이는 위양성 식별을 제거하기 위해 데이터의 추가 수동 큐레이션이 필요합니다. 또한, 어느 한 방법을 사용하여 확인 된 글리 칸의 유형은 유사합니다. 그들의 조성물에 기초하여 6개의 범주로 비닝된 후 글리칸의 각 유형의 비율은 두 방법16 사이에서 유사하다.
이중 Ti 방법으로부터의 포스포프로테오믹스 결과는 도 5에서 종래의 IMAC 포스포펩티드-단지 농축과 비교된다. 이중 기능적 Ti(IV) 농축은 단백질, 펩티드 및 PTM 수준에서 실질적인 중첩에 의해 나타난 바와 같이 종래의 IMAC와 유사하게 수행된다. 두 방법 중 하나를 사용하여 인산화 된 아미노산의 대부분은 세린과 트레오닌이며 약 1 %의 인산화 티로신도 확인됩니다. 두 방법 모두 또한 다중 인산화 펩티드를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
변형된 단백질의 리스트는 유전자에 맵핑되고 도 6 및 도 7에 도시된 바와 같이 유전자 온톨로지(GO) 농축을 사용하여 분석된다. ERLIC 및 IMAC를 사용하여 확인된 변형 단백질에 대한 GO 분석은 보충도 S4 및 보충도 S5에 나타내었다. 무료 온라인 메타스케이프 도구는 농축을 수행하고 풍부한 경로와 프로세스를 기반으로 네트워크를 생성하여 유사성23으로 연결합니다. 각 GO 분석에 대한 노드 항은 보충 표 S1, 보충 표 S2, 보충 표 S3 및 보충 표 S4에서 찾을 수 있다. 글리코실화는 세포외 매트릭스에서 주요 단백질 PTM이기 때문에, 확인된 N-당단백질의 리스트를 사용하여 농축된 몇몇 용어가 세포외 매트릭스와 관련된다는 것은 놀라운 일이 아니다. 인산화는 세포 신호전달에 관여하며, 이는 확인된 포스포단백질의 리스트를 사용하여 발견된 몇몇 농축된 용어로 볼 수 있다.
그림 2: N-글리코실화 및 인산화된 펩티드로부터의 주석이 달린 높은 신뢰도 MS/MS 스펙트럼. (A) 만노스-6-인산화 펩티드 GSLSYLN(HexNAc(2)Hex(7)Phospho(1))VTR은 7번째 농축 용출로부터 53.08-53.33분의 체류 시간으로부터 확인된 카텝신 D(CATD)로부터의 VTR이다. 243m/z에서 PhosphoHex 옥소늄 이온의 존재는 이 PTM 할당에 대한 신뢰도를 향상시킵니다. (b) 티오레독신 관련 막횡단 단백질 1(TMX1)로부터의 인산화된 펩티드 VEEEQEADEEDVS(Phospho)EEEAESK로부터의 체류 시간 32.31-32.72 분으로부터 여섯 번째 농축 용출. 펩티드 단편 이온과 그의 탈인산화 변이체 (단편*으로 표시됨) 사이의 -98 (-H3PO4) 중성 손실의 존재는 이러한 PTM 할당에 대한 신뢰를 향상시킨다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 일곱 용출에 걸친 이중 기능적 Ti(IV)-IMAC 농축으로부터의 펩티드 확인의 비교. 다수의 식별은 두 개의 기술적(injection) 반복실험 중 적어도 하나에서 확인된 펩티드를 포함한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 종래의 ERLIC 글리코펩티드 농축과 비교하여 이중 기능성 Ti(IV)-IMAC 농축으로부터의 글리코프로테오믹스의 비교 결과 . (A) 당단백질, 당형(단백질, 부위, 글리칸), 글리칸 조성물 및 농축 방법 간의 글리코사이트 식별의 벤 다이어그램. (B) 농축 방법 사이의 펩티드 골격에서 확인된 글리칸의 파이 차트. 글리칸은 그들의 조성16에 기초하여 6개의 그룹으로 결합된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 기존의 Ti(IV)-IMAC 포스포펩티드 농축과 비교하여 이중 작용성 Ti(IV)-IMAC 농축으로부터의 포스포프로테오믹스 결과의 비교. (A) 포스포단백질, 포스포펩티드 및 농축 방법 간의 포스포사이트 식별의 벤 다이어그램. (B) 아미노산 잔기에 의해 분해된 자신있게 국소화된(75% 이상의 확률) 포스포사이트의 파이 차트. (c) 다수의 인산화된 잔기에 의해 비닝된 확인된 포스포펩티드의 적층된 막대 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 이중 기능성 Ti(IV)-IMAC 농축을 사용하여 확인된 N-당단백질의 유전자 온톨로지 농축. N-당단백질은 유전자에 다시 매핑되고 상당히 농축된 경로 및 공정 조건은 게놈 전체를 배경으로 사용하여 확인됩니다. 다양한 색상이 용어 유사성으로 연결된 용어의 클러스터에 레이블을 지정하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 이중 기능성 Ti(IV)-IMAC 농축을 사용하여 확인된 포스포단백질의 유전자 온톨로지 농축. 포스포단백질은 유전자에 다시 매핑되고 상당히 농축된 경로 및 공정 조건은 게놈 전체를 배경으로 사용하여 확인됩니다. 다양한 색상이 용어 유사성으로 연결된 용어의 클러스터에 레이블을 지정하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 S1: 실시예 이중 작용성 Ti(IV)-IMAC(E1 내지 E7, 패널 A-G) 농축으로부터의 각각의 용출로부터의 총 이온 크로마토그램(TICs). 총 신호(이온 전류)는 117분 데이터 수집 기간에 걸쳐 플로팅된다. 베이스 피크의 강도는 NL 값에 의해 주어진다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 S2: 실시예 ERLIC (E1 내지 E5, 패널 A-E) 농축으로부터의 각각의 용출로부터의 총 이온 크로마토그램 (TICs). 총 신호(이온 전류)는 117분 데이터 수집 기간에 걸쳐 플로팅된다. 베이스 피크의 강도는 NL 값에 의해 주어진다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충도 S3: 실시예 Ti-IMAC 농축으로부터의 용출로부터의 총 이온 크로마토그램 (TIC). 총 신호(이온 전류)는 117분 데이터 수집 기간에 걸쳐 플로팅된다. 베이스 피크의 강도는 NL 값에 의해 주어진다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충도 S4: ERLIC을 이용한 통상적인 글리코펩티드 농축을 사용하여 확인된 N-당단백질의 유전자 온톨로지 농축. N-당단백질은 유전자에 다시 매핑되고 상당히 농축된 경로 및 공정 조건은 게놈 전체를 배경으로 사용하여 확인됩니다. 다양한 색상이 용어 유사성으로 연결된 용어의 클러스터에 레이블을 지정하는 데 사용됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충도 S5: Ti(IV)-IMAC를 사용한 통상적인 포스포펩티드 농축을 사용하여 확인된 포스포단백질의 유전자 온톨로지 농축. 포스포단백질은 유전자에 다시 매핑되고 상당히 농축된 경로 및 공정 조건은 게놈 전체를 배경으로 사용하여 확인됩니다. 다양한 색상이 용어 유사성으로 연결된 용어의 클러스터에 레이블을 지정하는 데 사용됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S1-S4: 유전자 온톨로지 농축 분석을 위한 메타스케이프 노드 정보. 표에는 이중 Ti를 사용하여 확인된 N-당단백질 및 포스포단백질(표 S1 및 표 S2), ERLIC을 이용한 N-당단백질(표 S3), 및 IMAC를 이용한 포스포단백질(표 S4)의 리스트에 대한 노드 정보가 포함되어 있다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이중 기능적 Ti(IV)-IMAC 전략은 단일 샘플 준비 워크플로우에서 동일한 샘플의 N-글리코펩티드와 포스포펩티드를 동시에 분석하는 데 유용합니다. ERLIC 기반 방법은 또한 PTM의 동시 농축을 수행하는 것으로 나타났습니다. 두 전략 모두 이전에 PTM 분석14,18에서 심층적 인 커버리지를 위해 사용되었습니다. 스핀 팁을 사용하여 샘플 인큐베이션 시간을 줄이기 위해 이중 Ti 방법을 적용 할 때,이 프로토콜이 자원 집약적 인 것이 줄어들어 더 널리 접근 할 수 있기를 바랍니다.
여러 PTM의 동시 분석은 농축 물질 표면의 분석물과 작용기 간의 상승 작용을 통해 달성됩니다. 스핀-팁솜으로 처음 패킹할 때, HILIC 모드에서의 글리코펩티드의 보유는 셀룰로스24 상의 히드록실기의 유병률로 인해 증가된다. 물과 아세토니트릴 (수혼화성 용매)을 사용함으로써, 글리코펩티드는 물과 유기층의 형성으로 인해 유지되고 분리된다. 이중 작용성 Ti(IV) 농축을 위한 물질은 포스포펩티드의 결합을 위한 고정화된 Ti(IV) 양이온에 의존한다. 물질의 측쇄의 친수성 특성은 글리코 펩티드를 HILIC 모드에서 보유하는 데 사용되며, 이는 수성 함량이 증가함에 따라 산성 용출을 사용하여 먼저 용출됩니다. 상기 물질은 다른 중성 글리코펩티드보다 고정상에 더 높은 친화성을 갖는 시알릴화 글리코펩티드를 용출시키기 위해 종래의 IMAC 포스포펩티드 농축 완충제로 추가로 세척된다. 물질을 염기성 pH로 컨디셔닝한 후, 수산화암모늄 및 ACN 용액은 포스포펩티드가 물질에 결합하도록 유지하는 정전기적 상호작용을 깨뜨리기 위해 사용된다. 한편, 유기 함량이 감소하면 모노- 및 다중 인산화 펩티드와 M6P 글리코펩티드의 분리가 가능하다.
동일한 워크플로우에서 여러 용출 단계를 사용하여 PTM을 분리할 때 제한된 샘플에서 생체 분자 정보를 최대화할 수 있습니다. 이러한 이중 PTM 분석 워크플로우의 주의사항은 적어도 5개의 분획이 수집될 때 각 농축을 위한 출발 물질로서 비교적 많은 양의 샘플(펩티드 0.5mg)의 요구 사항입니다. 그럼에도 불구하고, 여기에 제시된 동시 농축 전략은 여전히 기존의 전략에 비해 재료의 상당한 절약을 제공합니다. 보강 전에도 PTM 무결성을 보장하고 PTM 정보의 인공적인 손실을 방지하기 위해 몇 가지 중요한 단계가 필요합니다. 여기에는 사용하지 않을 때 저온 (이상적으로 -80 °C)에서 샘플의 적절한 저장, 단백질 추출 동안 프로테아제 및 포스파타제 억제제의 사용, 및 여기에 사용 된 HLB 카트리지와 같은 친수성 펩티드 클린업 방법의 사용이 포함됩니다.
ERLIC (종래의 글리코펩티드 농축)이 더 나은 글리코프로테옴 커버리지를 가져왔다는 것이 관찰된 반면, 이중 기능성 Ti(IV)-IMAC는 인포프로테오믹스 결과에서 종래의 Ti-IMAC에 의한 독특한 동정에서 능가하였다. 이중 Ti 농축 물질의 물리적 구조 및 ERLIC 물질의 친수성 증가는 ERLIC에서 개선된 글리코프로테옴 커버리지의 주요 요인일 가능성이 높다. 종래의 IMAC에서 포스포프로테옴의 증가된 커버리지는 첫 번째 용출 단계 및 세척 단계 동안 글리코펩티드의 제거로부터 감소된 이온 억제의 결과일 수 있다. 동시 이중 Ti 워크플로우를 사용하는 이러한 커버리지가 약간 감소했음에도 불구하고, 기존의 단일 PTM 보강과 상당한 중복은 여전히 두 개가 아닌 하나의 농축 워크플로우만 수행하는 추가적인 이점으로 달성됩니다.
시간 제약과 관련하여 ERLIC 및 기존 Ti-IMAC는 이중 Ti 워크플로우보다 분수가 적습니다. 필요한 자원과 관련하여 ERLIC에 필요한 음이온 교환 재료는 이중 Ti 및 기존 IMAC 워크 플로우에 필요한 기능화 된 재료보다 저렴합니다. 이들 프로토콜에서, 오직 N-연결된 글리코실화와 O-연결된 글리코실화가 분석되지 않았다. 효소 PNGase F는 O-글리코펩티드를 검색하는 경우 수득되는 위양성의 수를 제한하기 위해 N-글리칸을 절단하는데 사용될 수 있다(그리고 그래야만 한다). 그러나, 이러한 전략은 글리코펩티드 농축(25)에 대한 HILIC 및 ERLIC의 특이성을 감소시킨다는 것이 밝혀졌다. 프로토콜에서는 원시 데이터 파일을 분석하기 위해 두 개의 개별 소프트웨어를 사용하는 전략이 사용됩니다. 상용 소프트웨어 인 Byonic은 글리코 프로테오믹스 데이터를 분석하는 데 있어 황금 표준으로 간주됩니다. N-글리칸 구조의 다양성으로 인해, 펩티드 탐색 공간은 증가되고, 따라서 탐색 시간이 증가한다. 인산화는 또한 검색 동안 글리코실화 이외에 일반적인 PTM으로서 첨가될 수 있지만, 펩티드 다중 인산화가 고려되는지에 따라 검색 시간이 급증할 수 있다. 오픈 소스 소프트웨어인 MaxQuant는 포스포프로테오믹스 결과에서 FDR을 최소화하도록 최적화할 수 있지만, 복잡한 글리코실화는 검색하기에 용이하지 않습니다. 글리코프로테오믹 데이터(26,27,28)를 검색하기 위한 다른 오픈 소스 옵션도 있다. 이용 가능한 실험 목표 및 자원에 따라, 여기에 설명된 LC-MS 및 데이터 분석 파이프라인은 제시된 바와 같이 사용되거나 수정될 수 있다. 이 방법의 추가 최적화는 PTM의 적용 범위를 향상시킬 것으로 예상됩니다.
PTM은 그들이 부여하는 단백질 구조의 변화로 인해 생화학 적 과정에서 중요한 역할을합니다. 모든 프로테오믹 분석이 모든 단백질 PTM을 동시에 고려하는 것이 이상적입니다. 모든 단백질 글리코실화의 합에 대한 중요성은, 예를 들어, 메타-이질성29라고 불려왔다. 그러나 전체 PTM 분석의 목표는 현재 MS 기반 기술로는 아직 가능하지 않습니다. PTM 특이적 농축, 즉 HILIC 및 IMAC에 뒤따르는 상향식 프로테오믹스는 여전히 PTM 분석의 황금 표준이지만, 여기에 설명된 것과 같은 동시 농축 전략을 사용함으로써 생체 분자 정보를 더 잘 해명할 수 있다. 크로스토크 상호작용은 글리코실화 및 인산화(32)를 포함하는 다양한 PTMs(30,31) 사이에서 발생하는 것으로 밝혀졌다. 질병, 예를 들어 당뇨병 및 암과 같은 췌장 질환에서 이러한 상호 작용에 대한 정량적 분석은 질병 메커니즘에 대한 우리의 이해를 높이는 데 도움이 될 수 있습니다. 상이한 샘플 유형들 사이의 추출 방법의 최적화를 통해, 여기에 기술된 농축 프로토콜은 복잡한 생물학적 매트릭스에서 글리코프로테옴 및 포스포프로테옴의 심층 프로파일링에 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 및 R21AG065728) 및 청소년 당뇨병 연구 재단 (1-PNF-2016-250-S-B 및 SRA-2016-168-S-B)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 여기에 제시된 데이터는 위스콘신 대학교 임상 및 번역 연구 연구소를 통해 NIH / NCATS UL1TR002373 어워드의 지원을 통해 부분적으로 획득되었습니다. Orbitrap 장비는 NIH 공유 기기 보조금 (NIH-NCRR S10RR029531)과 위스콘신-매디슨 대학의 연구 및 대학원 교육 부총장 사무실의 지원을 통해 구입되었습니다. 우리는 또한 연구를 위해 인간의 췌장을 제공 한 위스콘신 대학 장기 및 조직 기증기구의 관대 한 지원과 Dan Tremmel, Sara D. Sackett 박사 및 Jon Odorico 교수의 도움을 받아 실험실에 샘플을 제공 한 것을 인정하고 싶습니다. 우리 연구팀은이 연구를 위해 조직을 기증 한 가족에게 특별한 감사를하고 싶습니다. L.L.은 위스콘신 대학 카르본 암 센터 (233-AAI9632)의 췌장암 파일럿 보조금 인 NIH 보조금 S10OD025084와 Vilas Distinguished Achievement Professorship 및 Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair Professorship을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid, Glacial (Certified ACS) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Scientific | A18-1 | |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus) | Fisher Scientific | A669-212 | |
| Byonic software | Protein Metrics | n/a | Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/) |
| C18 BEH material | Waters | 186002353 | Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet) |
| CAE-Ti-IMAC, 100% | J&K Scientific | 2749380-1G | Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment |
| Cellcrusher kit | Cellcrusher | n/a | Used for grinding tissue samples into powder before extraction |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-401-205 | For temperature-controlled centrifugation |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Sigma | 11697498001 | |
| DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | V3151 | Protein reducing agent |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | For sample lysis using ultrasonication |
| Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter) | Polymicro Technologies LLC | 100 m TSP075375 | For in-house pulled and packed columns with integrated emitter |
| Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Used for opening emitter of pulled capillary column |
| Iodoacetamide, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Protein reducing reagent |
| MaxQuant software | n/a | n/a | Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/) |
| Multi-therm Shaker with heating and cooling | Benchmark Scientific | H5000-HC | Heating block |
| Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk | Waters | 186000383 | Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each) |
| OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tips | Agilent | A57003100 | Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | For pulling nano-capillary columns for LC-MS |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma | 4906845001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å) | PolyLC | BMSX1203 | Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment |
| Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate | Next Advance | PC77-MAG | For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit |
| Proteome Discoverer software | Thermo Fisher Scientific | n/a | Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
| SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120 | Savant | n/a | Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat) |
| SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis | Fisher Scientific | BP2436200 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96 | Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile)) | Sigma | 90360-100ML | |
| Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea (Certified ACS) | Fisher Scientific | U15-500 | |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | W64 |
References
- Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
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- Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387 (2021).
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- Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
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