Summary
Posttranslationale Modifikationen (PTMs) verändern Proteinstrukturen und -funktionen. Methoden zur gleichzeitigen Anreicherung mehrerer PTM-Typen können die Abdeckung in Analysen maximieren. Wir präsentieren ein Protokoll mit dual-funktioneller Ti(IV)-immobilisierter Metallaffinitätschromatographie, gefolgt von Massenspektrometrie zur gleichzeitigen Anreicherung und Analyse der Protein-N-Glykosylierung und Phosphorylierung in Pankreasgeweben.
Abstract
Die Massenspektrometrie kann eine tiefe Abdeckung der posttranslationalen Modifikationen (PTMs) liefern, obwohl eine Anreicherung dieser Modifikationen aus komplexen biologischen Matrizen aufgrund ihrer geringen Stöchiometrie im Vergleich zu nicht modifizierten Analyten oft erforderlich ist. Die meisten Anreicherungs-Workflows von PTMs auf Peptiden in Bottom-up-Proteomik-Workflows, bei denen Proteine enzymatisch verdaut werden, bevor die resultierenden Peptide analysiert werden, reichern nur eine Art von Modifikation an. Es ist jedoch das gesamte Komplement von PTMs, das zu biologischen Funktionen führt, und die Anreicherung einer einzigen Art von PTM kann ein solches Übersprechen von PTMs übersehen. PTM-Übersprechen wurde zwischen Proteinglykosylierung und Phosphorylierung beobachtet, den beiden häufigsten PTMs in menschlichen Proteinen und auch den beiden am meisten untersuchten PTMs unter Verwendung von Massenspektrometrie-Workflows. Unter Verwendung der hier beschriebenen simultanen Anreicherungsstrategie werden beide PTMs aus postmortalem menschlichem Pankreasgewebe, einer komplexen biologischen Matrix, angereichert. Die dual-funktionelle Ti(IV)-immobilisierte Metallaffinitätschromatographie wird verwendet, um verschiedene Formen der Glykosylierung und Phosphorylierung gleichzeitig in mehreren Fraktionen in einer bequemen Spinspitzen-basierten Methode zu trennen, die nachgelagerte Analysen potenzieller PTM-Crosstalk-Wechselwirkungen ermöglicht. Dieser Anreicherungs-Workflow für Glyko- und Phosphopeptide kann auf verschiedene Probentypen angewendet werden, um eine tiefe Profilierung mehrerer PTMs zu erreichen und potenzielle Zielmoleküle für zukünftige Studien zu identifizieren.
Introduction
Protein-posttranslationale Modifikationen (PTMs) spielen eine wichtige Rolle bei der Modulation von Proteinstrukturen und damit ihrer Funktionen und nachgelagerten biologischen Prozesse. Die Vielfalt des menschlichen Proteoms nimmt aufgrund der kombinatorischen Variabilität verschiedener PTMs exponentiell zu. Verschiedene Varianten von Proteinen aus ihren kanonischen Sequenzen, wie sie vom Genom vorhergesagt werden, werden als Proteoformen bezeichnet, und viele Proteoformen entstehen ausPTMs 1. Die Untersuchung der proteoformen Vielfalt in Gesundheit und Krankheit ist in den letzten Jahren zu einem Forschungsgebiet von großem Interessegeworden 2,3.
Das Studium von Proteoformen und insbesondere von PTMs mit großer Tiefe ist durch die Entwicklung von auf Massenspektrometrie (MS) basierenden Proteomikmethoden einfacher geworden. Mit MS werden Analyten ionisiert, fragmentiert und basierend auf dem m/z von Fragmenten identifiziert. Anreicherungsmethoden sind aufgrund der geringen relativen Häufigkeit von PTMs im Vergleich zu nicht modifizierten Formen von Proteinen oft notwendig. Obwohl die Analyse intakter Proteine und ihrer PTMs, die sogenannten Top-Down-Analysen, routinemäßiger geworden sind, ist die enzymatische Verdauung von Proteinen und die Analyse ihrer Komponentenpeptide in Bottom-up-Analysen immer noch der am weitesten verbreitete Weg für die PTM-Analyse. Die beiden am häufigsten untersuchten PTMs und die beiden häufigsten PTMs in vivo sind Glykosylierung und Phosphorylierung4. Diese beiden PTMs spielen eine wichtige Rolle bei der Zellsignalisierung und -erkennung und sind daher wichtige Modifikationen, die in der Krankheitsforschung charakterisiert werden müssen.
Die chemischen Eigenschaften verschiedener PTMs bieten oft Wege zur Anreicherung dieser PTMs auf Protein- und Peptidebene vor der Analyse. Die Glykosylierung ist ein hydrophiles PTM aufgrund der Häufigkeit von Hydroxylgruppen auf jedem Monosaccharid. Diese Eigenschaft kann verwendet werden, um Glykopeptide in der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) anzureichern, die mehr hydrophile Glykopeptide von den hydrophoben, nicht modifizierten Peptidentrennen können 5. Die Phosphorylierung fügt den Phosphatanteil hinzu, der außer bei saurem pH-Wert negativ geladen ist. Aufgrund dieser Ladung können verschiedene Metallkationen, einschließlich Titan, verwendet werden, um Phosphopeptide anzuziehen und zu binden, während nicht phosphorylierte Spezies weggespült werden. Dies ist das Prinzip der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie (IMAC). Weitere Erörterungen dieser und anderer Anreicherungsstrategien für Glykosylierung und Phosphorylierung finden sich in den letzten Reviews 6,7.
Vergleichsweise große Mengen an Ausgangspeptidmaterial (0,5 mg oder mehr) werden aufgrund der geringen Stöchiometrie von PTMs an Peptiden häufig für Anreicherungsprotokolle benötigt. In Szenarien, in denen diese Probenmenge möglicherweise nicht leicht gewonnen werden kann, wie z. B. Tumorkernbiopsie oder Liquoranalysen, ist es vorteilhaft, einfache Arbeitsabläufe zu verwenden, die zu maximalen biomolekularen Informationen führen. Jüngste Strategien, die von unserem Labor und anderen entwickelt wurden, haben die gleichzeitige und parallele Analyse von Glykosylierung und Phosphorylierung unter Verwendung desselben PTM-Anreicherungsworkflows 8,9,10,11,12 hervorgehoben. Obwohl sich die chemischen Eigenschaften dieser beiden PTMs unterscheiden können, können diese PTMs aufgrund der innovativen Trenntechniken und verwendeten Materialien in mehreren Schritten analysiert werden. Zum Beispiel überlagert die elektrostatische Abstoßungs-hydrophile Wechselwirkungschromatographie (ERLIC) Trennungen basierend auf hydrophilen Wechselwirkungen zwischen Analyten und der mobilen Phase mit Ladungs-Ladungs-Wechselwirkungen zwischen Analyten und dem stationären Phasenmaterial13,14,15,16. Bei saurem pH-Wert kann die Anziehung phosphorylierter Peptide in die stationäre Phase ihre Retention und Trennung von nicht modifizierten Peptiden verbessern. Material, das aus Ti(IV) besteht, das auf hydrophilen Mikrosphären immobilisiert ist, kann für HILIC- und IMAC-basierte Elution verwendet werden, um Phosphopeptide und neutrale, saure und Mannose-6-phosphorylierte Glykopeptide17,18 zu trennen. Diese Strategie wird als dual-funktionales Ti(IV)-IMAC bezeichnet. Die Verwendung dieser Strategien zur Anreicherung mehrerer PTMs in einem einzigen Workflow kann Analysen potenzieller PTM-Crosstalk-Interaktionen zugänglicher machen. Darüber hinaus sind die Gesamtprobenmenge und der Zeitaufwand geringer als bei den herkömmlichen Anreicherungsmethoden, wenn sie parallel durchgeführt werden (d. h. HILIC und IMAC auf separaten Probenaliquoten).
Um die dual-funktionelle Ti(IV)-IMAC-Strategie für die gleichzeitige Analyse von Proteinglykosylierung und Phosphorylierung zu demonstrieren, haben wir sie zur Analyse von postmortalem menschlichem Pankreasgewebe angewendet. Die Bauchspeicheldrüse produziert sowohl Verdauungsenzyme als auch regulatorische Hormone, einschließlich Insulin und Glucagon. Die Pankreasfunktion ist bei Bauchspeicheldrüsenerkrankungen beeinträchtigt. Bei Diabetes ist die Regulierung des Blutzuckers betroffen, was zu höheren Glukosespiegeln im Blut führt. Bei Pankreatitis resultiert eine Entzündung aus der Autoverdauung desOrgans 3. Veränderungen der PTM-Profile, einschließlich Glykosylierung und Phosphorylierung, können, wie es oft der Fall ist, bei anderen Krankheiten auftreten.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine Spin-Tip-basierte simultane Anreicherungsmethode, basierend auf einer dual-funktionellen Ti(IV)-IMAC-Strategie, für N-Glykopeptide und Phosphopeptide, die aus Proteinen gewonnen werden, die aus Pankreasgewebe extrahiert werden. Das Protokoll umfasst Proteinextraktion und -verdauung, Anreicherung, MS-Datenerfassung und Datenverarbeitung, wie in Abbildung 1 dargestellt. Repräsentative Daten aus dieser Studie sind über das ProteomeXchange-Konsortium mit der Kennung PXD033065 verfügbar.
Abbildung 1: Workflow zur simultanen Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus humanem Pankreasgewebe. Gewebe werden zunächst vor der Proteinextraktion mit dem Waschmittel Natriumdodecylsulfat (SDS) zu einem feinen Pulver pulverisiert. Proteine werden dann einer enzymatischen Verdauung unterzogen. Die resultierenden Peptide werden vor der Anreicherung mit dual-funktionellem Ti(IV)-IMAC aliquotiert. Die Rohdaten werden mittels nanoskaliger Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (nRPLC-MS) gesammelt und mit Hilfe einer Datenbanksuchsoftware analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Dieses Protokoll soll PTM-Analysen zugänglicher machen und eine umfassendere Analyse mehrerer PTMs im selben Workflow ermöglichen. Dieses Protokoll kann auf andere komplexe biologische Matrizen, einschließlich Zellen und Bioflüssigkeiten, angewendet werden.
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Protocol
Es wurde die Zustimmung für die Verwendung von Pankreasgewebe für die Forschung von den nächsten Angehörigen des Verstorbenen eingeholt und eine Genehmigung des University of Wisconsin-Madison Health Sciences Institutional Review Board eingeholt. Eine IRB-Aufsicht ist nicht erforderlich, da sie keine menschlichen Probanden betrifft, wie in 45 CFR 46.102 (f) anerkannt.
VORSICHT: Beim Umgang mit den in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien, zu denen Säuren (Ameisen, Essigsäure, Trifluoressigsäure), Basen (Ammoniumhydroxid) und Kryogene (flüssiger Stickstoff) gehören, ist Vorsicht geboten. Lesen Sie die Sicherheitsdatenblätter für die verwendeten Reagenzien, um sich mit den damit verbundenen Gefahren und erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen vertraut zu machen. Prozentual angegebene Konzentrationen sind Volumen/Gesamtvolumen (v/v) und werden mit Wasser verdünnt.
1. Kryopulverisierung, Lyse und Proteinextraktion von Geweben
- Füllen Sie einen Dewar mit flüssigem Stickstoff. Kühlen Sie die Teile des Gewebepulverisierers, die mit dem Pankreasgewebe in Kontakt kommen, nämlich die Kammer, der Pulverisierer und der Erholungslöffel, in einem Styroporbehälter vor.
- Die gefrorenen Gewebestücke in den vorgekühlten Probenhalter geben und einen Löffel flüssigen Stickstoff in das Gewebe geben.
- Legen Sie den Pulverisierer in die Kammer und schlagen Sie ihn fünf- bis zehnmal mit einem Schlägel an, um die Probe zu zerkleinern. Entfernen Sie den Pulverisierer aus der Kammer und kratzen Sie anhaftendes Gewebepulver und Stücke ab.
- Fügen Sie einen Löffel flüssigen Stickstoff in die Kammer hinzu, wenn das Gewebe zu schmelzen beginnt. Wiederholen Sie den Pulverisierungsprozess, bis die Probe ein feines Pulver ohne große Gewebebrocken ist. Portionieren Sie die Proben in ca. 100 mg Aliquots in vorgekühlte Röhrchen.
- Bereiten Sie einen Lysepuffer vor, der 4% Natriumdodecylsulfat (SDS), 150 mM NaCl und 25 mM Tris (pH = 7,4) enthält. Lösen Sie jeweils eine Tablette Protease und Phosphatase-Inhibitor in 500 μL Wasser auf, um jeweils einen 20-fachen Vorrat zu erhalten. Fügen Sie das erforderliche Volumen von 20x Vorrat jedes Inhibitors zum Lysepuffer hinzu, um eine endgültige 1x-Konzentration zu erhalten.
- 600 μL Lysepuffer pro 100 mg Gewebe in die Tube geben und bei 95 °C in einem Heizblock für 10 min mit Schütteln bei 800 U/min inkubieren. Nehmen Sie die Proben aus dem Heizblock und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen.
- Beschallen Sie die Proben mit 60 W Energie (20 kHz) für 45 s mit 15 s Impulsen mit einer Pause von 30 s dazwischen. Pelletieren Sie die Proben bei 3.000 x g für 15 min bei 4 °C.
- Fügen Sie den Überstand zu einem 5x Fällungslösungsmittel, 300 μL Lysepuffer zu 1,5 ml Fällungslösungsmittel hinzu, das 50% Aceton, 49,9% Ethanol und 0,1% Essigsäure enthält. Über Nacht bei -20 °C kühlen.
- Pelletieren Sie die Proben erneut bei 3.000 x g für 15 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie das Pellet, indem Sie es mit einem Spatel aufbrechen und mit der gleichen Menge an Fällungslösungsmittel mischen. Pellet erneut und wiederholen Sie den Waschschritt 2x.
- Pelletieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 15 min bei 4 °C. Das Probenpellet 15 min in einem Abzug an der Luft trocknen und bei -80 °C lagern, bis es fahrbereit ist.
2. Proteinverdauung und Entsalzung
- Resuspendiert das Proteinpellet in 300 μL frisch hergestelltem Verdauungspuffer, der 50 mM Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) und 8 M Harnstoff enthält.
- Schätzen Sie die Proteinkonzentration der Lösung mit einem Proteinassay gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Zu dem Protein in der Lösung Dithiothreitol (DTT) zu einer Endkonzentration von 5 mM hinzufügen, mischen und bei Raumtemperatur für 1 h reduzieren. Dann fügen Sie Iodacetamid (IAA) zu einer Endkonzentration von 15 mM hinzu, mischen und alkylieren Sie bei Raumtemperatur für 30 min im Dunkeln. Quench-Alkylierung durch Wiederholung der Zugabe von DVB-T im gleichen Volumen wie zuvor und Mischen.
- LysC/Trypsin im Enzym:Protein-Verhältnis 1:100 zugeben und bei 37 °C für 4 h inkubieren. Dann fügen Sie 50 mM TEAB hinzu, um den 8 M Harnstoff zu verdünnen, der zur < von 1 M verwendet wird. Trypsin im Enzym:Protein-Verhältnis 1:100 hinzufügen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Quen Sie den Aufschluss unter Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) auf 0,3% v/v. Für jedes 1 mg Startprotein eine Entsalzungskartusche (1 cc, 10 mg) mit 1 ml Acetonitril (ACN) und 3x mit 1 ml 0,1% TFA konditionieren.
- Die verdaute Mischung auf die Entsalzungskartusche geben. Waschen Sie die Mischung 3x mit 1 ml 0,1% TFA. Wenn die Elution langsam ist, üben Sie Überdruck aus, vermeiden Sie jedoch eine Durchflussrate > einem Tropfen pro Sekunde.
- Eluierte Peptide mit 1 ml 60% ACN und 0,1% Ameisensäure (FA) Lösung. Trocken eluierte Peptide bei ca. 35 °C mit einem zentrifugalen Vakuumkonzentrator, bis das Lösungsmittel vollständig verdampft ist.
- Resuspendieren Sie Peptide in 300 μL Wasser und schätzen Sie die Peptidkonzentrationen mit einem Peptidassay gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die Peptide in 500 μg Aliquots portionieren und vollständig trocknen.
3. ERLIC N-Glykopeptid-Anreicherung
HINWEIS: Die genauen Zentrifugengeschwindigkeiten und -zeiten können je nach Probe variieren und müssen optimiert werden. Im Allgemeinen sind 300 x g für 2 min für die Konditionierung und das Waschen des Materials und 100 x g für 5 min für die Elutierung geeignet.
- Wiegen Sie ca. 3 mg Watte und verpacken Sie sie in eine leere 200 μL Pipettenspitze (Schleuderspitze; siehe Materialtabelle).
- Starkes Anionenaustausch-Anreicherungsmaterial in ein Röhrchen überführen und 200 μL 0,1% TFA pro 10 mg Material hinzufügen. Zur Anreicherung von 500 μg Peptiden verwenden Sie 15 mg des Materials. Aktivieren Sie das Material durch Schütteln für 15 min.
- Legen Sie die Spinspitze mit einem Schlauchadapter über ein 2-ml-Röhrchen und fügen Sie der Spitze genügend Aufschlämmung für 15 mg Material hinzu. Entfernen Sie die Flüssigkeit, indem Sie sie in einer Tischzentrifuge drehen.
- Konditionieren Sie das Material, indem Sie 3x mit 200 μL ACN zentrifugieren. Wiederholen Sie die dreifache Konditionierung mit 100 mM Ammoniumacetat (NH4Ac), 1% TFA und 80% ACN/0,1% TFA (Ladepuffer).
- Resuspendieren Sie 500 μg Peptidproben in etwa 200 μL Ladepuffer und fließen Sie durch die Spinspitze. Laden Sie den Durchfluss 2x nach, um eine vollständige Bindung zu gewährleisten.
- Waschen Sie das Material, indem Sie 5x mit 200 μL 80% ACN/0,1% TFA zentrifugieren und dann 2x mit 200 μL 80% ACN/0,1% FA.
- Eluieren Sie die Peptide durch Zentrifugieren mit jeweils 200 μL: 50% ACN/0,1% FA (E1); 0,1% FA (E2); 0,1% TFA (E3); 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).
- Waschen Sie das Material, indem Sie 2x mit 200 μL 80% ACN/5% NH4OH zentrifugieren. Eluieren Sie die restlichen Peptide mit 200 μL 10% NH4OH (E5).
- Trocknen Sie alle Elutien vollständig mit einem Zentrifugal-Vakuumkonzentrator bei ca. 35 °C.
- Entsalzen Sie die Grundelution (E5) mit einer Entsalzungsspitze gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Die Elution von der Entsalzungsspitze mit einem zentrifugalen Vakuumkonzentrator bei ca. 35 °C bis zur Vollständigkeit trocknen.
4. Ti(IV)-IMAC Phosphopeptid-Anreicherung
HINWEIS: Die genauen Zentrifugengeschwindigkeiten und -zeiten können je nach Probe variieren und müssen optimiert werden. Im Allgemeinen sind 300 x g für 2 min für die Konditionierung und das Waschen des Materials und 100 x g für 5 min für die Elutierung geeignet.
- Wiegen Sie ca. 3 mg Watte und packen Sie sie in eine leere 200 μL Pipettenspitze (Spin-Tip).
- Ti-IMAC Phosphopeptid-Anreicherungsmaterial in ein Röhrchen überführen und 200 μL 0,1% TFA pro 10 mg Material hinzufügen. Zur Anreicherung von 500 μg Peptiden verwenden Sie 10 mg Material.
- Legen Sie die Schleuderspitze mit einem Röhrchenadapter über ein 2-ml-Röhrchen und fügen Sie der Spitze genügend Aufschlämmung für 10 mg Material hinzu. Entfernen Sie die Flüssigkeit, indem Sie sie in einer Tischzentrifuge drehen.
- Konditionieren Sie das Material mit 200 μL 40% ACN/3% TFA unter Verwendung der gleichen Zentrifugeneinstellungen wie oben beschrieben. Resuspendieren Sie Peptidproben in 200 μL von 40% ACN / 3% TFA und fließen Sie durch die Spin-Spitze. Laden Sie den Durchfluss zweimal nach, um eine vollständigere Bindung zu gewährleisten.
- Waschen Sie das Material durch Zentrifugieren mit 200 μL 50% ACN, 6% TFA und 200 mM NaCl-Lösung, gefolgt von 2x in 200 μL 30% ACN und 0,1% TFA-Lösung.
- Elute Peptide mit 200 μL von 10% NH 4 OH. Trocknen Sie die Elution vollständig unter Vakuum. Führen Sie die Entsalzung mit einer Entsalzungsspitze gemäß dem Protokoll des Herstellers durch. Trocknen Sie die Elution von der Entsalzungsspitze unter Vakuum bis zur Vollständigkeit.
5. Dual-funktionelle Ti(IV)-Simultananreicherung
HINWEIS: Die genauen Zentrifugengeschwindigkeiten und -zeiten können je nach Probe variieren und müssen optimiert werden. Im Allgemeinen sind 300 x g für 2 min für die Konditionierung und das Waschen des Materials und 100 x g für 5 min für die Elutierung geeignet.
- Wiegen Sie etwa 3 mg Watte und packen Sie sie in eine leere Schleuderspitze.
- Übertragen Sie ca. 1 g Ti(IV)-IMAC-Material in ein Röhrchen. Zugabe von 0,1 % TFA zu einer bekannten Materialkonzentration, z. B. 20 mg/200 μL (Material kann in dieser Suspension bei 4 °C gelagert werden).
- Für die Anreicherung von 500 μg Peptiden fügen Sie genügend Aufschlämmung zu einer Spin-Spitze hinzu, um 20 mg Material zu übertragen. Waschen Sie die Schleuderspitze durch Zentrifugieren mit 200 μL 0,1% TFA.
- Resuspendieren Sie die Proben in 200 μL Lade-/Waschlösungsmittel (80% ACN und 3% TFA) und fließen Sie durch die Schleuderspitze. Laden Sie den Durchfluss 2x neu.
- Waschen Sie die Schleuderspitze 6x durch Zentrifugieren mit 200 μL Lade-/Waschlösungsmittel. Waschen Sie die Schleuderspitze mit 200 μL 80% ACN/0,1% FA-Lösung.
- Eluieren Sie die Peptide mit jeweils 200 μL von den folgenden: 60% ACN/0,1% FA (E1) und 40% ACN/0,1% FA (E2). Analysieren Sie jede Elution separat.
- Eluten Sie die Peptide mit jeweils 200 μL der folgenden Punkte: 20% ACN/0,1% FA und 0,1% FA. Kombinieren Sie die beiden Elutionen und analysieren Sie sie als eine Probe (E3).
- Eluieren Sie die Peptide mit jeweils 200 μL der folgenden: 40% ACN/3% TFA; 50 % ACN/6 % TFA, 200 mM NaCl; und 30 % ACN/0,1 % TFA. Kombinieren Sie diese Elionen und analysieren Sie sie nach dem Entsalzen mit einer verpackten Spitze als eine (E4).
- Konditionieren Sie das Material auf den basischen pH-Wert mit 200 μL 90% ACN/2,5% NH4OH für 3x. Entsorgen Sie diese Wäschen.
- Eluieren Sie die Peptide mit jeweils 200 μL: 60% ACN/10% NH 4 OH (E5) und 40% ACN/10% NH4OH (E6). Analysieren Sie diese Elutien separat nach dem Entsalzen mit einer verpackten Spitze.
- Eluieren Sie die Peptide mit jeweils 200 μL der folgenden: 20% ACN/10% NH4OH; 10 % ACN/10 % NH4OH; und 10% NH4 OH. Kombinieren Sie diese Elutien und analysieren Sie sie nach dem Entsalzen mit einer verpackten Spitze als eine (E7).
- Trocknen Sie alle Elutien vollständig unter Vakuum.
6. Nano-Flow-Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (nRPLC-MS)
HINWEIS: MS-Datenerfassungs- und Analysemethoden sind vielfältig, und daher wird hier in den folgenden Schritten nur eine vorgeschlagene LC-MS-Pipeline (und die damit verbundenen Parameter) beschrieben. Proben, die unter Verwendung der zuvor beschriebenen Probenvorbereitungs- und Anreicherungsschritte erzeugt wurden, können mit anderen instrumentellen Aufbauten, einschließlich der Verwendung kommerziell erhältlicher chromatographischer Säulen, bei ausreichender Datenqualität analysiert werden.
- Ziehen und verpacken Sie eine 15 cm lange Kapillare (75 μm Innendurchmesser) mit C18-Material, wie in19 beschrieben. Bereiten Sie die mobile Phase A (0,1% FA in Wasser) und die mobile Phase B (0,1% FA in ACN) vor.
- Rekonstituieren Sie angereicherte Peptidproben in 15 μL von 3% mobiler Phase B. Laden Sie 2 μL der Probe (~13% Probenvolumen) direkt auf die Säule. Analysieren Sie jede Probe im technischen Duplikat.
- Elute Peptide mit einem Gradienten von 3% bis 30% mobiler Phase B über 90 min bei einer Durchflussrate von 0,3 μL/min. Waschen Sie die Säule mit 75% B für 8 Minuten, gefolgt von 95% B für 8 min, und beenden Sie die Methode mit einer Gleichgewichtung bei 3% B für 12 min.
- Betrieb des Massenspektrometers im positiven Ionenmodus durch datenabhängige Erfassung der Top-20-Peaks mit folgenden Parametern: Sprühspannung 2 kV; MS1-Erkennung in LC/MS von 400-2.000 m/z bei 120.000 Auflösung, 2E5 Automatic Gain Control (AGC) Target, 100 ms maximale Einspritzzeit, 30% HF-Linse, Quadrupolisolierung mit 1,6 m/z Fenster, für Ladezustände 2-8 und unbestimmt und 30 s dynamischer Ausschluss; MS2-Detektion im LC/MS unter Verwendung einer abgestuften HCD-Fragmentierung bei 22 %, 30 % und 38 %, einer festen ersten Masse von 120 m/z bei einer Auflösung von 30.000, einem 5E4-AGC-Ziel und einer Mindestintensität von 2,5E4.
7. MS-Datenanalyse
HINWEIS: Eine Datenanalyse-Pipeline mit zwei verschiedenen Softwares zur Analyse desselben Datensatzes wird hier vorgestellt. Phosphorylierung und Glykosylierung können gleichzeitig mit einer einzigen Software anstelle von zwei separaten Software, wie hier beschrieben, durchsucht werden, obwohl im Allgemeinen die Softwaresuchzeit proportional zum Suchraum ist, d. H. Anzahl der betrachteten PTMs. Aus diesem Grund werden parallel zur Suche nach Glykopeptiden und Phosphopeptiden zwei verschiedene Software eingesetzt.
- Verarbeiten Sie Rohdatendateien mit der entsprechenden Software (siehe Materialverzeichnis).
- Suche nach Spektren in der UniProt Humandatenbank (oder einer geeigneten artspezifischen) Datenbank. Setzen Sie die Carbamidomethylierung von Cys als feste Modifikation. Legen Sie die maximale Anzahl der verpassten enzymatischen Spaltungen auf zwei fest.
- Suchen Sie in den Rohdatendateien mit einer kommerziellen Software (siehe Tabelle der Materialien) nach Glykopeptiden, dieanalysiert werden sollen 20. Verwenden Sie eine Vorläufermassentoleranz von 10 ppm und eine Fragmentmassentoleranz von 0,01 Da mit einer minimalen Peptidlänge von vier Resten.
- Suchen Sie mit der in die Software eingebetteten N-Glykan-Datenbank, die um typische Mannose-6-phosphat(M6P)-Glykane erweitert wurde, einschließlich HexNAc(2)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Phospho(1) und HexNAc(3)Hex(3-4)Phospho(1).
- Setzen Sie die N-Glykosylierung als übliche Modifikation. Legen Sie die maximalen Gesamtmodifikationen pro Peptid-Spektralübereinstimmung (PSM) als eine häufige und zwei seltene fest.
- Legen Sie die folgenden variablen Modifikationen fest: Oxidation von Met (selten), Deamidation bei Asn und Gln (selten) und Phosphorylierung bei Ser, Thr und Tyr (häufig). Legen Sie die folgenden Identifikationsfilter fest: Score-Cutoff-> 150, |Log-Prob| > 1 und Delta Mod > 10.
- Exportieren und analysieren Sie Suchergebnisse auf den Registerkarten Proteine und Peptidgruppe.
- Scannen Sie die Identifikationen, die M6P-Glykane enthalten, manuell auf das Vorhandensein des PhosphoHex-Oxoniumions (243 m/z) in den MS/MS-Spektren und entfernen Sie falsch positive Identifikationen, die dieses diagnostische Ion nicht enthalten.
- Suchen Sie in den Rohdatendateien mit einer Open-Source-Software (siehe Materialverzeichnis) nach Phosphopeptiden, die analysiert werdensollen 21. Verwenden Sie eine Peptidtoleranz von 20 ppm für die erste Suche und eine Peptidtoleranz von 4,5 ppm für die Hauptsuche.
- Setzen Sie die maximale Anzahl von Modifikationen pro Peptid auf 5. Setzen Sie die PSM- und Protein-False-Discovery-Rate (FDR) auf 1% und die minimale Peptidlänge auf 7 Reste.
- Legen Sie variable Modifikationen wie Oxidation bei Met, N-terminale Proteinacetylierung und Phosphorylierung bei Ser, Thr und Tyr fest. Analysieren Sie Suchergebnisse mit den modificationSpecificPeptides-Dateien.
- Bestimmen Sie die Anzahl der Identifizierungen von PTMs auf Protein-, Peptid- und Modifikationsstellenebene.
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Representative Results
Repräsentative Massenspektrometriedaten, einschließlich Rohdateien und Suchergebnisse, wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD03306522 an das ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt.
In dieser Arbeit wurden doppelte Injektionsreplikate für jede Anreicherungselution analysiert. Identifikationen aus beiden technischen Replikaten wurden in der Endanalyse zusammengetragen. Aufgrund der semi-stochastischen Natur der datenabhängigen Erfassung bei der Auswahl von Peptidvorläufern für die MS/MS-Fragmentierung wird eine Identifizierungsüberlappung von etwa 70%-80% zwischen technischen Duplikaten erwartet. Bei Anwendungen, die diese Methoden verwenden, werden mindestens zwei technische Replikate gefördert. Für nachgelagerte statistische Analysen sollten biologische Replikate für verschiedene experimentelle Bedingungen berücksichtigt werden. Abhängig von der gewünschten Stringenz für die Datenberichterstattung kann es sinnvoll sein, Filter für Identifizierungen festzulegen, z. B. Identifizierung in mindestens x Anzahl von zu meldenden technischen oder biologischen Replikaten.
Ein Beispiel für ein Gesamtionenchromatogramm (TIC) für jede Elution aus jeder Anreicherung ist in der ergänzenden Abbildung S1, der ergänzenden Abbildung S2 und der ergänzenden Abbildung S3 zu sehen. Die Verwendung strenger Filter bei der Datenbanksuche von MS-Rohdateien kann eine genauere und zuverlässigere Identifizierung von MS / MS-Spektren für Peptidsequenzen mit PTMs gewährleisten. Wie in den TICs für jede Elution ersichtlich ist, sind die Peptidproben auch nach der Fraktionierung aus der Anreicherung noch komplex. Die Nanoströmungschromatographie, die mit einem hochauflösenden, massengenauen und schnell scannenden Massenspektrometer gekoppelt ist, kann dazu beitragen, komplexe Mischungen wie Peptide aus einem tryptischen Digest mit großer Empfindlichkeit und Tiefe zu analysieren. Beispiele für MS/MS-Spektren für glykosylierte und phosphorylierte Spektren sind in Abbildung 2 dargestellt. Gut kommentierte Spektren wie diese resultieren aus einer reichen Fragmentierung von Vorläufern, die das Vertrauen in die von der Datenbanksuchsoftware zugewiesene Identifizierung erhöhen.
Abbildung 3 veranschaulicht die Peptididentifikationen, die unter Verwendung der dual-funktionellen Ti(IV)-IMAC-Spin-Tip-Anreicherungsmethode über jede Elutionsfraktion vorgenommen wurden. Die Mehrheit der Glykopeptide eluiert in den ersten vier Fraktionen, während die Mehrheit der Phosphopeptide in den letzten drei Fraktionen eluiert. Diese Trennung verschiedener PTMs zwischen den Fraktionen trägt dazu bei, Interferenzen in der Ionisation zu vermeiden, die auftreten können, wenn sie nicht so ausreichend über Elutions getrennt wären.
Abbildung 4 vergleicht die Glykoproteomik-Ergebnisse der dualen Ti-Methode im Vergleich zu einer ERLIC-Glykopeptid-Nur-Anreicherung. Wie in Abbildung 4A zu sehen ist, sind viele Identifizierungen auf Protein-, Glykoform-, PTM- und Modifikationsstellenebene beiden Methoden gemeinsam. ERLIC hat jedoch im Vergleich zur dualen Ti-Methode mehr eindeutige Identifikationen auf allen Ebenen. Dazu gehören M6P-Glykoformen (hohe Mannoseglykane mit mindestens einer Phosphatgruppe), die eine zusätzliche manuelle Kuratierung der Daten erfordern, um falsch positive Identifikationen zu entfernen. Darüber hinaus sind die Arten von Glykanen, die mit beiden Methoden identifiziert wurden, ähnlich. Die Anteile jeder Glykanart nach dem Binning in sechs Kategorien, basierend auf ihrer Zusammensetzung, sind zwischen beiden Methoden16 ähnlich.
Phosphoproteomics-Ergebnisse aus der dualen Ti-Methode werden in Abbildung 5 mit einer herkömmlichen IMAC-Phosphopeptid-Nur-Anreicherung verglichen. Die dual-funktionelle Ti(IV)-Anreicherung verläuft ähnlich wie bei herkömmlichem IMAC, wie eine erhebliche Überlappung auf Protein-, Peptid- und PTM-Ebene zeigt. Bei beiden Methoden handelt es sich bei der Mehrheit der phosphorylierten Aminosäuren um Serin und Threonin, wobei auch etwa 1% phosphoryliertes Tyrosin identifiziert wurde. Beide Methoden können auch verwendet werden, um multiphosphorylierte Peptide zu identifizieren.
Die Listen der modifizierten Proteine werden Genen zugeordnet und mittels Genontologie-Anreicherung (GO) analysiert, wie in Abbildung 6 und Abbildung 7 gezeigt. GO-Analysen für die mit ERLIC und IMAC identifizierten modifizierten Proteine sind in Ergänzende Abbildung S4 und Ergänzungsabbildung S5 dargestellt. Das kostenlose Online-Tool Metascape führt die Anreicherung durch und schafft Netzwerke auf der Grundlage angereicherter Pfade und Prozesse und verbindet sie durch Ähnlichkeit23. Die Knotenterme für jede GO-Analyse finden Sie in der ergänzenden Tabelle S1, der ergänzenden Tabelle S2, der ergänzenden Tabelle S3 und der ergänzenden Tabelle S4. Da die Glykosylierung ein wichtiges Protein PTM in der extrazellulären Matrix ist, ist es nicht verwunderlich, dass mehrere Begriffe, die mit der Liste der identifizierten N-Glykoproteine angereichert wurden, mit der extrazellulären Matrix zusammenhängen. Die Phosphorylierung ist an der Zellsignalisierung beteiligt, und dies kann in mehreren angereicherten Begriffen gesehen werden, die anhand der Liste der identifizierten Phosphoproteine gefunden wurden.
Abbildung 2: Annotierte MS/MS-Spektren mit hohem Konfidenzniveau aus N-glykosylierten und phosphorylierten Peptiden. (A) Mannose-6-phosphoryliertes Peptid GSLSYLN(HexNAc(2)Hex(7)Phospho(1))VTR aus Cathepsin D (CATD), identifiziert aus Retentionszeiten 53,08-53,33 min aus der siebten Anreicherungselution. Das Vorhandensein des PhosphoHex-Oxoniumions bei 243 m/z verbessert das Vertrauen in diese PTM-Zuordnung. (B) Phosphoryliertes Peptid VEEEQEADEEDVS(Phospho)EEEAESK aus Thioredoxin-verwandtem Transmembranprotein 1 (TMX1) aus Retentionszeiten 32,31-32,72 min ab der sechsten Anreicherungselution. Das Vorhandensein von -98 (-H3PO4) neutralen Verlusten zwischen Peptidfragmentionen und ihren dephosphorylierten Varianten (gekennzeichnet durch Fragment*) verbessert das Vertrauen in diese PTM-Zuordnung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Vergleich der Peptididentifikationen aus der dual-funktionellen Ti(IV)-IMAC-Anreicherung über sieben Elutions. Die Anzahl der Identifizierungen umfasst Peptide, die in mindestens einem der beiden technischen (Injektions-) Replikate identifiziert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Vergleich der Glykoproteomik resultiert aus einer dual-funktionellen Ti(IV)-IMAC-Anreicherung im Vergleich zu einer konventionellen ERLIC-Glykopeptid-Anreicherung . (A) Venn-Diagramme von Glykoprotein, Glykoform (Protein, Ort, Glykan), Glykanzusammensetzung und Glykositidentifikationen zwischen Anreicherungsmethoden. (B) Kreisdiagramme von Glykanen, die auf Peptid-Rückgraten zwischen Anreicherungsmethoden identifiziert wurden. Glykane werden basierend auf ihrer Zusammensetzung in sechs Gruppeneingeteilt 16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Vergleich der Phosphoproteomik resultiert aus einer dual-funktionellen Ti(IV)-IMAC-Anreicherung im Vergleich zu einer konventionellen Ti(IV)-IMAC-Phosphopeptid-Anreicherung. (A) Venn-Diagramme von Phosphoprotein-, Phosphopeptid- und Phosphosit-Identifikationen zwischen Anreicherungsmethoden. (B) Kreisdiagramme von sicher lokalisierten (75 % oder höherer Wahrscheinlichkeit) Phosphossiten, aufgeschlüsselt nach Aminosäureresten. (C) Gestapeltes Balkendiagramm der identifizierten Phosphopeptide, die durch eine Reihe phosphorylierter Reste gebunden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Genontologische Anreicherung von N-Glykoproteinen, identifiziert mittels dual-funktioneller Ti(IV)-IMAC-Anreicherung. N-Glykoproteine werden auf Gene zurückgebildet und signifikant angereicherte Signalwege und Prozessbegriffe anhand der Gesamtheit des Genoms als Hintergrund identifiziert. Verschiedene Farben werden verwendet, um Cluster von Begriffen zu kennzeichnen, die durch Termähnlichkeit verbunden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Genontologische Anreicherung von Phosphoproteinen, identifiziert mittels dual-funktioneller Ti(IV)-IMAC-Anreicherung. Phosphoproteine werden auf Gene zurückgebildet und signifikant angereicherte Signalwege und Prozessbegriffe werden anhand der Gesamtheit des Genoms als Hintergrund identifiziert. Verschiedene Farben werden verwendet, um Cluster von Begriffen zu kennzeichnen, die durch Termähnlichkeit verbunden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung S1: Beispiel Gesamtionenchromatogramme (TICs) aus jeder Elution aus dual-funktioneller Ti(IV)-IMAC (E1 bis E7, Panels A-G) Anreicherung. Das Gesamtsignal (Ionenstrom) wird über den 117-minütigen Datenerfassungszeitraum aufgezeichnet. Die Intensität des Basispeaks wird durch den Wert NL angegeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Beispiel Gesamtionenchromatogramme (TICs) aus jeder Elution aus ERLIC (E1 bis E5, Panels A-E) Anreicherung. Das Gesamtsignal (Ionenstrom) wird über den 117-minütigen Datenerfassungszeitraum aufgezeichnet. Die Intensität des Basispeaks wird durch den Wert NL angegeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S3: Beispiel Gesamtionenchromatogramm (TIC) aus der Elution aus der Ti-IMAC-Anreicherung. Das Gesamtsignal (Ionenstrom) wird über den 117-minütigen Datenerfassungszeitraum aufgezeichnet. Die Intensität des Basispeaks wird durch den Wert NL angegeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S4: Genontologische Anreicherung von N-Glykoproteinen, identifiziert mittels konventioneller Glykopeptidanreicherung mit ERLIC. N-Glykoproteine werden auf Gene zurückgebildet und signifikant angereicherte Signalwege und Prozessbegriffe anhand der Gesamtheit des Genoms als Hintergrund identifiziert. Verschiedene Farben werden verwendet, um Cluster von Begriffen zu kennzeichnen, die durch Termähnlichkeit verbunden sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S5: Genontologische Anreicherung von Phosphoproteinen, identifiziert mittels konventioneller Phosphopeptid-Anreicherung mit Ti(IV)-IMAC. Phosphoproteine werden auf Gene zurückgebildet und signifikant angereicherte Signalwege und Prozessbegriffe werden anhand der Gesamtheit des Genoms als Hintergrund identifiziert. Verschiedene Farben werden verwendet, um Cluster von Begriffen zu kennzeichnen, die durch Termähnlichkeit verbunden sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabellen S1-S4: Metascape-Knoteninformationen für Genontologie-Anreicherungsanalysen. Tabellen enthalten Knoteninformationen für Listen von N-Glykoproteinen und Phosphoproteinen, die mit Dual-Ti (Tabelle S1 und Tabelle S2), N-Glykoproteinen mit ERLIC (Tabelle S3) und Phosphoproteinen mit IMAC (Tabelle S4) identifiziert wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Die dual-funktionelle Ti(IV)-IMAC-Strategie ist nützlich für die gleichzeitige Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus derselben Probe in einem einzigen Probenvorbereitungs-Workflow. Es wurde auch gezeigt, dass ERLIC-basierte Methoden eine gleichzeitige Anreicherung von PTMs durchführen. Beide Strategien wurden zuvor für Deep Coverage in PTM-Analyseneingesetzt 14,18. Durch die Anpassung der dualen Ti-Methode an die Verkürzung der Probeninkubationszeit durch die Verwendung von Spin-Tips hoffen wir, dass dieses Protokoll weniger ressourcenintensiv und damit breiter zugänglich geworden ist.
Die gleichzeitige Analyse mehrerer PTMs erfolgt durch synergistische Wechselwirkungen zwischen Analyten und den funktionellen Gruppen auf der Oberfläche des Anreicherungsmaterials. Bei der ersten Verpackung von Spin-Tips mit Baumwolle ist die Retention von Glykopeptiden im HILIC-Modus aufgrund der Prävalenz von Hydroxylgruppen auf Cellulose24 erhöht. Durch die Verwendung von Wasser und Acetonitril (ein wassermischbares Lösungsmittel) werden Glykopeptide aufgrund der Bildung von Wasser und organischen Schichten zurückgehalten und getrennt. Das Material für die dualfunktionelle Ti(IV)-Anreicherung ist abhängig von den immobilisierten Ti(IV)-Kationen zur Bindung von Phosphopeptiden. Die hydrophilen Eigenschaften der Seitenketten des Materials werden genutzt, um Glykopeptide im HILIC-Modus zurückzuhalten, die zunächst mittels saurer Elution mit steigendem wässrigem Gehalt eluiert werden. Das Material wird weiter mit herkömmlichen IMAC-Phosphopeptid-Anreicherungspuffern gewaschen, um sialylierte Glykopeptide zu eluieren, die eine höhere Affinität zur stationären Phase aufweisen als andere neutrale Glykopeptide. Nach der Konditionierung des Materials auf den basischen pH-Wert, Ammoniumhydroxid und ACN-Lösung wird verwendet, um die elektrostatischen Wechselwirkungen zu brechen, die Phosphopeptide an das Material binden. In der Zwischenzeit ermöglicht der abnehmende organische Gehalt die Trennung von mono- und multiphosphorylierten Peptiden und M6P-Glykopeptiden.
Bei der Trennung von PTMs mit mehreren Elutionsschritten im selben Workflow können biomolekulare Informationen aus begrenzten Proben maximiert werden. Ein Vorbehalt bei solchen dualen PTM-Analyse-Workflows ist die Anforderung einer relativ großen Menge an Probe (0,5 mg Peptide) als Ausgangsmaterial für jede Anreicherung, wenn mindestens fünf Fraktionen gesammelt werden. Dennoch bietet die hier vorgestellte Simultananreicherungsstrategie im Vergleich zu herkömmlichen Strategien immer noch eine deutliche Materialeinsparung. Bereits vor der Anreicherung sind mehrere wichtige Schritte notwendig, um die PTM-Integrität sicherzustellen und einen künstlichen Verlust von PTM-Informationen zu vermeiden. Dazu gehören die ordnungsgemäße Lagerung von Proben bei niedrigen Temperaturen bei Nichtgebrauch (idealerweise -80 °C), die Verwendung von Protease- und Phosphataseinhibitoren während der Proteinextraktion und die Verwendung einer hydrophilen Peptidreinigungsmethode, wie sie hier verwendet werden.
Es wurde beobachtet, dass ERLIC (konventionelle Glykopeptidanreicherung) zu einer besseren Glykoproteomabdeckung führte, während duale funktionelle Ti(IV)-IMAC bei eindeutigen Identifikationen durch konventionelles Ti-IMAC in Phosphoproteomik-Ergebnissen übertroffen wurde. Die physikalische Struktur und erhöhte Hydrophilie des ERLIC-Materials im Vergleich zu der des dualen Ti-Anreicherungsmaterials ist wahrscheinlich ein wichtiger Faktor für die verbesserte Glykoproteomabdeckung in ERLIC. Die erhöhte Abdeckung des Phosphoproteoms in herkömmlichem IMAC kann auf eine verminderte Ionensuppression durch die Entfernung von Glykopeptiden während der ersten Elutionsschritte und Waschschritte zurückzuführen sein. Trotz dieser leichten Abnahme der Abdeckung durch den simultanen Dual-Ti-Workflow wird immer noch eine signifikante Überschneidung mit der herkömmlichen Einzel-PTM-Anreicherung erreicht, mit dem zusätzlichen Vorteil, dass nur ein Anreicherungs-Workflow anstelle von zwei durchgeführt wird.
In Bezug auf Zeitbeschränkungen haben ERLIC und herkömmliche Ti-IMAC weniger Bruchteile als der duale Ti-Workflow. In Bezug auf die benötigten Ressourcen ist das für ERLIC benötigte Anionenaustauschmaterial billiger als das funktionalisierte Material, das für die dualen Ti- und herkömmlichen IMAC-Workflows benötigt wird. In diesen Protokollen wurde nur die N-verknüpfte und nicht die O-verknüpfte Glykosylierung analysiert. Das Enzym PNGase F kann (und sollte) verwendet werden, um N-Glykane zu spalten, um die Anzahl der falsch positiven Ergebnisse zu begrenzen, die bei der Suche nach O-Glykopeptiden erhalten werden. Es hat sich jedoch gezeigt, dass diese Strategie die Spezifität von HILIC und ERLIC für die Glykopeptidanreicherungreduziert 25. Im Protokoll wird eine Strategie verwendet, die zwei separate Software verwendet, um Rohdatendateien zu analysieren. Byonic, eine kommerzielle Software, gilt als Goldstandard bei der Analyse von Glykoproteomik-Daten. Aufgrund der Vielfalt der N-Glykanstrukturen wird der Peptidsuchraum vergrößert, wodurch die Suchzeiten verlängert werden. Phosphorylierung kann auch als häufiges PTM zusätzlich zur Glykosylierung während der Suche hinzugefügt werden, obwohl die Suchzeiten explodieren können, je nachdem, ob eine Peptid-Multiphosphorylierung in Betracht gezogen wird. MaxQuant, eine Open-Source-Software, kann optimiert werden, um FDR in Phosphoproteomik-Ergebnissen zu minimieren, obwohl eine komplexe Glykosylierung nicht so einfach zu durchsuchen ist. Es gibt auch andere Open-Source-Optionen für die Suche nach glykoproteomischen Daten26,27,28. Abhängig von den verfügbaren experimentellen Zielen und Ressourcen kann die hier beschriebene LC-MS- und Datenanalyse-Pipeline wie vorgestellt verwendet oder modifiziert werden. Eine weitere Optimierung der Methoden soll die Abdeckung der PTMs verbessern.
PTMs spielen aufgrund der Veränderungen der Proteinstruktur, die sie vermitteln, eine wichtige Rolle in biochemischen Prozessen. Ideal ist, dass alle proteomischen Analysen alle Protein-PTMs gleichzeitig berücksichtigen. Die Bedeutung der Summe aller Proteinglykosylierungen wurde beispielsweise als Metaheterogenität29 bezeichnet. Das Ziel einer vollständigen PTM-Analyse ist mit aktuellen MS-basierten Technologien jedoch noch nicht möglich. Bottom-up-Proteomik, gefolgt von PTM-spezifischer Anreicherung, d.h. HILIC und IMAC, ist immer noch der Goldstandard für PTM-Analysen, obwohl durch die Verwendung gleichzeitiger Anreicherungsstrategien, wie sie hier beschrieben werden, biomolekulare Informationen besser aufgeklärt werden können. Es wurde festgestellt, dass Cross-Talk-Wechselwirkungen zwischen verschiedenen PTMs 30,31 auftreten, einschließlich Glykosylierung und Phosphorylierung32. Die quantitative Analyse solcher Wechselwirkungen bei Krankheiten, zum Beispiel bei Bauchspeicheldrüsenerkrankungen wie Diabetes und Krebs, kann sich als fruchtbar erweisen, um unser Verständnis von Krankheitsmechanismen zu verbessern. Mit der Optimierung der Extraktionsmethoden zwischen verschiedenen Probentypen können die hier beschriebenen Anreicherungsprotokolle zur eingehenden Profilierung des Glykophoroteoms und des Phosphoproteoms in komplexen biologischen Matrizen verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde zum Teil durch Zuschüsse des NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 und R21AG065728) und der Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B und SRA-2016-168-S-B) unterstützt. Die hier vorgestellten Daten wurden zum Teil auch durch die Unterstützung eines NIH/NCATS UL1TR002373 Award durch das Institute for Clinical and Translational Research der University of Wisconsin gewonnen. Die Orbitrap-Instrumente wurden durch die Unterstützung eines NIH Shared Instrument Grant (NIH-NCRR S10RR029531) und des Office of the Vice Chancellor for Research and Graduate Education an der University of Wisconsin-Madison erworben. Wir möchten auch die großzügige Unterstützung der Organ- und Gewebespendeorganisation der University of Wisconsin anerkennen, die die menschliche Bauchspeicheldrüse für die Forschung zur Verfügung gestellt hat, und die Hilfe von Dan Tremmel, Dr. Sara D. Sackett und Prof. Jon Odorico für die Bereitstellung der Proben für unser Labor. Unser Forschungsteam möchte sich besonders bei den Familien bedanken, die für diese Studie Taschentücher gespendet haben. L.L. würdigt den NIH-Zuschuss S10OD025084, einen Pankreaskrebs-Pilotzuschuss des Carbone Cancer Center der University of Wisconsin (233-AAI9632) sowie eine Vilas Distinguished Achievement Professorship und die Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair Professorship mit Mitteln der Wisconsin Alumni Research Foundation und der University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid, Glacial (Certified ACS) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Scientific | A18-1 | |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus) | Fisher Scientific | A669-212 | |
| Byonic software | Protein Metrics | n/a | Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/) |
| C18 BEH material | Waters | 186002353 | Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet) |
| CAE-Ti-IMAC, 100% | J&K Scientific | 2749380-1G | Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment |
| Cellcrusher kit | Cellcrusher | n/a | Used for grinding tissue samples into powder before extraction |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-401-205 | For temperature-controlled centrifugation |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Sigma | 11697498001 | |
| DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | V3151 | Protein reducing agent |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | For sample lysis using ultrasonication |
| Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter) | Polymicro Technologies LLC | 100 m TSP075375 | For in-house pulled and packed columns with integrated emitter |
| Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Used for opening emitter of pulled capillary column |
| Iodoacetamide, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Protein reducing reagent |
| MaxQuant software | n/a | n/a | Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/) |
| Multi-therm Shaker with heating and cooling | Benchmark Scientific | H5000-HC | Heating block |
| Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk | Waters | 186000383 | Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each) |
| OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tips | Agilent | A57003100 | Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | For pulling nano-capillary columns for LC-MS |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma | 4906845001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å) | PolyLC | BMSX1203 | Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment |
| Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate | Next Advance | PC77-MAG | For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit |
| Proteome Discoverer software | Thermo Fisher Scientific | n/a | Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
| SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120 | Savant | n/a | Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat) |
| SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis | Fisher Scientific | BP2436200 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96 | Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile)) | Sigma | 90360-100ML | |
| Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea (Certified ACS) | Fisher Scientific | U15-500 | |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | W64 |
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