Ingénierie et caractérisation d’un modèle optogénétique de la jonction neuromusculaire humaine
Summary
Nous décrivons un système d’imagerie reproductible, automatisé et impartial pour caractériser la fonction de la jonction neuromusculaire à l’aide de tissus musculaires squelettiques et de motoneurones optogénétiques. Ce système permet la quantification fonctionnelle de la connectivité neuromusculaire au fil du temps et détecte la diminution de la fonction neuromusculaire causée par les neurotoxines et la myasthénie grave du sérum du patient.
Abstract
De nombreuses maladies neuromusculaires, telles que la myasthénie grave (MG), sont associées à un dysfonctionnement de la jonction neuromusculaire (NMJ), qui est difficile à caractériser dans les modèles animaux en raison des différences physiologiques entre les animaux et les humains. L’ingénierie tissulaire offre la possibilité de fournir des modèles in vitro de NMJ humains fonctionnels qui peuvent être utilisés pour diagnostiquer et étudier les pathologies NMJ et tester des thérapies potentielles. En incorporant des protéines optogénétiques dans les cellules souches pluripotentes induites (CSPi), nous avons généré des neurones qui peuvent être stimulés avec des longueurs d’onde de lumière spécifiques. Si le NMJ est sain et fonctionnel, un signal neurochimique du motoneurone entraîne une contraction musculaire. Grâce à l’intégration de l’optogénétique et de la microfabrication à l’ingénierie tissulaire, nous avons établi une méthodologie impartiale et automatisée pour caractériser la fonction NMJ à l’aide de l’analyse vidéo. Un protocole standardisé a été développé pour la formation de NMJ, la stimulation optique avec enregistrement vidéo simultané et l’analyse vidéo de la contractilité tissulaire. La stimulation des motoneurones optogénétiques par la lumière pour induire des contractions musculaires squelettiques récapitule la physiologie humaine du NMJ et permet des mesures fonctionnelles répétées du NMJ au fil du temps et en réponse à divers intrants. Nous démontrons la capacité de cette plateforme à montrer des améliorations fonctionnelles de la connectivité neuromusculaire au fil du temps et à caractériser les effets néfastes des anticorps MG ou des neurotoxines des patients sur la fonction NMJ.
Introduction
La jonction neuromusculaire (NMJ) est la synapse chimique entre les motoneurones (MN) et les cellules musculaires squelettiques (SkM) qui permet la contraction musculaire. Les toxines, telles que la neurotoxine α-bungarotoxine (BTX), ou les maladies neuromusculaires (NMD) comme la myasthénie grave (MG) peuvent entraîner une dégénérescence de la NMJ et des réductions du contrôle musculaire1. Les modèles de tissus humains issus de la bioingénierie récapitulent mieux les mécanismes fonctionnels et physiologiques des NMJ humains et offrent un plus grand potentiel de traduction que les modèles animaux.
Bien que les modèles animaux aient fait progresser la compréhension de la formation et de la fonction du NMJ, il existe des différences significatives entre les synapses humaines et animales qui limitent la traduction des résultats chez l’homme et rendent la caractérisation in vivo du NMJ difficile 2,3,4. Des études ont montré des différences physiologiques distinctes entre les NMJ de souris et les NMJ humains. Les souris ont des NMJ plus importants et des densités de zone active plus petites par rapport aux NMJ humains4. De plus, les études sur les médicaments menées sur des modèles animaux ne reflètent pas toujours les effets observés dans les essais cliniques chez l’homme. Les modèles de tissus humains modifiés offrent la possibilité d’étudier le développement sain de la NMJ et la pathologie des maladies neuromusculaires et permettent des dépistages de médicaments. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs)5 peuvent être différenciées en une variété de types de cellules, y compris les cellules musculaires squelettiques 6,7 et les motoneurones 8,9. Les CSHS peuvent être générés facilement à partir des cellules des patients, ce qui permet une meilleure modélisation de la maladie10 et un dépistage des médicaments11,12 grâce à des modèles tissulaires spécifiques au patient.
Les co-cultures monocouches bidimensionnelles (2D) de SkM et de MN n’ont pas la morphologie, le phénotype, l’organisation et le comportement fonctionnel des NMJ physiologiques. Les NMJ se forment aléatoirement en culture 2D, ce qui inhibe l’isolement des unités motrices pour l’analyse, limite les mesures fonctionnelles précises et empêche leur utilisation pour des expériences répétées et systématiques13 . Les modèles tissulaires tridimensionnels (3D) des NMJ surmontent bon nombre de ces limitations, récapitulant les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des NMJ physiologiques 7,14,15,16,17. À l’aide de ce modèle, les deux types de tissus sont développés séparément, puis intégrés en dirigeant la croissance axonale, ce qui permet aux NMJ plus organisés de se développer par rapport aux systèmes de culture 2D.
Notre étude précédente a démontré que la combinaison de l’optogénétique avec l’ingénierie tissulaire peut permettre une stimulation et une évaluation non invasives précises de la fonction NMJ18,19. Grâce au génie génétique, les protéines sensibles à la lumière peuvent être intégrées dans le génome des hiPSC. L’intégration de la channelrhodopsine-2 (ChR2), un canal ionique qui s’ouvre en réponse à la lumière bleue, dans la membrane des cellules excitables telles que les neurones permet un contrôle spatio-temporel sans contact de l’activation cellulaire 20,21,22. Les hiPSC porteurs de ChR2 peuvent être différenciés en motoneurones optogénétiques sensibles à la lumière bleue, éliminant ainsi le besoin d’électrodes invasives typiques qui stimulent les neurones et évitant la stimulation indésirable des cellules musculaires par des électrodes23. Ce système utilise des motoneurones optogénétiques pour stimuler les contractions dans les cellules musculaires squelettiques non optogénétiques. La combinaison de l’acquisition vidéo et de l’éclairage contrôlé de la lumière bleue permet aux tissus co-cultivés d’être simultanément stimulés et enregistrés pour la fonction NMJ.
La MG est causée par des auto-anticorps ciblant les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (AChR), ce qui entraîne une diminution de la fonction NMJ et une faiblesse musculaire24. Il est diagnostiqué en fonction des symptômes présentés, de l’électrodiagnostic et de la détection d’auto-anticorps via des tests sanguins sérologiques. Cependant, tous les auto-anticorps impliqués dans la MG n’ont pas été identifiés, et certains patients séronégatifs reçoivent un diagnostic de MG mais sans anticorps reconnus25,26. Notre système permet une évaluation fonctionnelle répétée du NMJ avant et après l’ajout de sérum chez les patients atteints de MG, fournissant des informations inestimables sur les changements fonctionnels et biochimiques causés par les anticorps MG18. Notre protocole illustre comment produire des modèles 3D in vitro de NMJ humain fonctionnel qui peuvent être utilisés pour diagnostiquer et étudier les pathologies NMJ et tester des thérapies potentielles. Nous démontrons la polyvalence du système en deux plates-formes, un dispositif microfluidique et une plus grande plate-forme de bioréacteur à puits ouvert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce système est un modèle de tissu humain 3D qui combine l’optogénétique et le traitement vidéo pour permettre une évaluation automatisée et impartiale de la fonction NMJ. En utilisant un protocole standardisé, nous avons démontré la capacité de mesurer les changements dans la fonction NMJ au cours du développement physiologique et de caractériser les effets néfastes de pathologies telles que l’exposition aux neurotoxines et la myasthénie grave des sérums de patients.
Des é…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions chaleureusement le nih [numéros de subvention EB025765 et EB027062], le DOD [numéro de bourse W81XWH-18-1-0095] et l’UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Nous remercions chaleureusement le noyau de cellules souches de l’Université Columbia pour son aide et ses conseils en matière de reprogrammation cellulaire.
Materials
| Cells | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| Media and Supplements | |||
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
| MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NBactiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
| Plasticware | |||
| 30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
| 37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
| 546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25×36 | |
| 594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
| Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| Optics | |||
| pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| Molds | |||
| Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| Growth Factors | |||
| Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
| Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
| Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
| Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
| Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
| Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
| Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
| Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| Antibodies | |||
| α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
| Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
| Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
| Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipment | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
| Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
| Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software | |||
| Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS elements | Nikon | Basic Research | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |
References
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